关于地塞米松对肺纤维化大鼠TNFα、IL8 和NO表达的影响

【摘要】 目的 观察地塞米松对博莱霉素(bleomycin ，BLM)致肺纤维化1周大鼠肺泡巨噬细胞（AM）分泌TNFα、IL8和NO的影响，探讨地塞米松治疗特发性肺纤维化（IPF）的作用机制。方法 取Wistar大鼠5只，向气管内灌注BLM复制肺纤维化模型后7 d处死动物，通过支气管肺泡灌洗获取AM，将其分为地塞米松（DEX）组和空白对照组，用DEX干预AM（空白对照组只加培养基），然后检测AM分泌TNFα、IL8、NO的能力。结果 用地塞米松处理AM后的培养上清中，TNFα、IL8、NO含量减少，与空白对照组比较有显著性差异（P＜0.05）。结论 地塞米松可能通过减少AM分泌TNFα、IL8、NO，从而干预肺间质纤维化的发生发展。
【关键词】 肺纤维化 肺泡巨噬细胞 地塞米松
　　【Abstract】 Objective To investigate the effect of dexamethasone on concentration of TNFα，IL8，NO produced by alveolar macrophages（AMs） in bleomycininduced rat pulmonary fibrosis.Methods Five adult female wistar rats were intratracheally instilled with BLM. After 7 days， the rats were killed by right ventricle of heart exsanguinations under ketamine anaesthesia and bronchoalveolar lavage (BAL) was performed to obtain AMs. AMs were pided into two groups，dexamethasone group and control group. Cultured medium was collected when cultured 36 hours after joining dexamethasone. The concentration of TNFα，IL8，NO in cultured medium was detected.Results The concentration of TNFα，IL8，NO in cultured medium coming from dexamethasone group was lower than that coming from control group.Conclusion Dexamethasone could reduce the secretion of TNFα，IL8，NO in AMs，which may be the possible mechanism of antifibrosis.
　　【Key words】 pulmonary fibrosis，alveolar macrophage，dexamethasone
　　特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis ， IPF)是以肺泡及间质性炎症起病、继以肺泡结构进行性损害、细胞外基质蛋白胶原沉积为特征的慢性炎症性疾病［1］，其分为两个阶段，即早期肺泡炎阶段及后期炎症损伤后过度修复的肺纤维化阶段。目前国内外多数学者认为在肺泡腔内占绝对多数的肺泡巨噬细胞（AM）在肺纤维化的发病机制中起一个中心环节的作用［2］，在AM分泌的众多细胞因子中，TGFβ、PDGF、TNFα、IL8、NO、IL1等参与肺泡炎和/或肺纤维化的形成，异常活化的细胞因子和炎症介质形成一个复杂而多变的网络，参与肺纤维化的发生发展。多数研究发现，在BLM致大鼠肺纤维化模型中，气管内灌注BLM后第7天时肺泡炎最重，以后逐渐减轻，而AM可能起中心环节的作用，早期抑制肺泡巨噬细胞的活化及其炎性介质的释放可能有助于阻断肺纤维化的形成。因此，本实验通过观察地塞米松(dexamethasone ，DEX)对BLM致肺纤维化大鼠1周的AM分泌炎性因子的影响，探讨其抗纤维化可能作用机制。
　　1 材料与方法
　　1.1 肺纤维化模型的复制 取体重180～200 g的健康雌性Wistar大鼠5只，实验条件下饲养1周，用氯胺酮（100 mg/kg体重）腹腔注射麻醉大鼠，在无菌操作下作颈部正中切口，逐层暴露气管，用1 ml注射器（前带7号针头）抽取含BLM（5 mg /kg）的生理盐水0.2～0.3 ml，经两气管软骨环间隙朝向心端刺入气管，将大鼠直立，继续朝向心端进针约1.0～1.5 cm，回抽无阻力，抽回空气，将药液注入气管，旋转动物，使药液在肺内分布充分、均匀。于气管内灌注后第7天处死动物。右心室采血处死动物，经肺动脉插管注入磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗双肺至肺脏呈苍白胶冻样，结扎左主支气管，右肺用PBS行支气管肺泡灌洗，回收液集中于无菌瓶中，过滤，离心，收集细胞。细胞悬液用培养液在培养瓶中经37℃、5%CO2、100%饱和水蒸汽的细胞培养箱内孵育纯化，弃培养液，收集贴壁纯化的AM备用。
　　1.2 AM的分组 空白对照组：致纤维化处理1周的大鼠AM的培养；DEX组：致纤维化处理1周的大鼠AM加入地塞米松(2.5 μg/ml)后的培养。两组AM采用24孔培养板培养，各组设8个复孔，每孔细胞数为2.0×105个，培养36 h后收集条件上清液，备用。
　　1.3 培养上清中TNFα、IL8、NO的检测 TNFα和IL8水平的检测采用双抗体夹心ELISA法。以抗大鼠TNFα或IL8 mAb包被酶标板，加入待测样本或标准品与之结合后，加入生物素化的检测抗体，洗板；再加入辣根过氧化物酶标记的亲合素，洗板；加入显色剂显色。于波长450 nm处测定A值，通过绘制标准曲线即可得知待测样本中TNFα或IL8的浓度。采用酶法通过测定NO的代谢产物NO-2及NO-3，反映NO的水平。
　　1.4 统计学处理 用SPSS统计软件，进行t检验，以双侧α＝0.05为检验标准，P＜0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　用地塞米松处理后AM分泌TNFα、IL8、NO的水平明显降低，与空白对照组比较有显著性差异（P＜0.05），详见表1。表1 地塞米松对BLM致肺纤维化大鼠1周的AM分泌注：组间比较，*P＜0.05
　　3 讨论
　　AM分布于呼吸道肺泡表面，是支气管肺泡灌洗液（BALF）中数量最多的细胞，占BALF细胞总数的90%以上。AM表面有多种表面标志，它既是免疫调节细胞又是免疫效应细胞。AM可分泌TNFα、IL1、PDGF、TGFβ、IL6、IL8等多种细胞因子和炎症介质，它们形成一个复杂而多变的网络。糖皮质激素作为IPF治疗的一线药物，是一种强有效的免疫抑制剂，有非特异性抗炎作用，但目前有关糖皮质激素治疗肺间质纤维化的机制尚未完全阐明。肖永久等［3］研究发现地塞米松作用于博莱霉素诱导的肺纤维化中，肺泡炎性细胞所占比例明显比单纯的肺纤维化要低很多，且胶原的积聚程度也明显比肺纤维化组低。周彩存等［４］研究发现氢化可的松组肺纤维化程度和TGFβ1表达程度较BLM组明显减轻，提示氢化可的松对肺间质炎症和纤维化的抑制作用可能与其抑制肺组织TGFβ1表达有关。在本实验中，经地塞米松处理博莱霉素致肺纤维化1周的AM，其分泌TNFα、IL8、NO的能力明显下降，与对照组比较有显著差异。
　　有关TNFα与肺纤维化的研究颇多，在正常肺内，TNFα及其mRNA主要表达在肺泡和间质巨噬细胞，TNFα对单核细胞趋化蛋白1、细胞粘附分子1、血管细胞粘附分子1等具有上调作用，从而促使巨噬细胞迁移至受累局部；TNFα可与IL1起协同作用，激活中性粒细胞，介导肺泡炎症反应；TNFα能刺激肺成纤维细胞增殖，对胶原合成有一定促进作用。有研究发现BLM气管注射后肺组织总TNFα含量及其mRNA 量均较对照组明显增加，应用抗TNFα抗体能使小白鼠免患BLM引起的肺间质炎症和纤维化［5］。本实验中，经地塞米松处理博莱霉素致肺纤维化1周的AM分泌TNFα的能力明显下降。
　　IL8是一种重要的炎性细胞因子，在IPF患者，其血清和BALF中IL8水平均高于正常对照组，血清IL8水平可反映IPF中性粒细胞肺泡炎程度，也可作为临床上监测IPF患者疾病活动性的有用指标，进一步的研究发现，AM的IL8mRNA表达也升高，AM被认为是下呼吸道中IL8的主要来源［6］。肺泡巨噬细胞和肺成纤维细胞分泌大量IL8，趋化中性粒细胞和单核细胞形成肺泡炎，提示IL8在肺纤维化中起重要作用。在本实验中，DEX组AM分泌IL8的能力明显下降，提示地塞米松抗纤维化的作用可能与其抑制IL8的表达有关。

NO是一种内源性血管舒张剂、炎症介质和神经递质，也是肺损伤的重要介质。正常肺组织的气道上皮和AM只有极少iNOS表达，而IPF患者肺组织，iNOS在AM、中性粒细胞、肺泡上皮呈强阳性表达。在石英诱导的肺纤维化中，NO不仅损伤肺组织，而且与超氧阴离子结合，形成毒性更强的过氧亚硝酸阴离子，通过不同机制在肺内产生广泛的细胞毒性，NO能使肺成纤维细胞活化、增殖、iNOSmRNA表达增加，早期的纤维化损伤与肺成纤维细胞中iNOS表达增加有关，iNOS基因上调是成纤维细胞对炎症刺激发生增殖反应的早期事件，及早采取干预措施，减少NO的过量产生，有可能延缓肺纤维化［7］。在本实验中，经地塞米松处理博莱霉素致肺纤维化1周的AM，其分泌NO的能力明显下降，与对照组比较有显著差异。
　　因此，地塞米松可能通过减少T淋巴细胞和巨CC患者外周血中Survivin mRNA的阳性率为45.7%，而对照组仅为13.3%，两者相比较有明显差异（P＜0.05）。检测外周血细胞Survivin mRNA表达诊断RCCC敏感性为45.7％，特异性为86.7%。本研究中有46例RCCC患者同时留取标本和外周血，其中肿瘤组织Survivin mRNA 阳性表达为29例，表达率为63.0%；外周血细胞Survivin mRNA 阳性表达为21例，表达率为45.7％。虽然肿瘤组织较外周血细胞中Survivin mRNA表达高，但两者表达统计具有相关性（P＜0.01），说明表达Survivin mRNA在RCCC肿瘤组织和外周血细胞中具有一致性。外周血中检测到的Survivin mRNA是RCCC释放入血的肿瘤细胞中的Survivin mRNA，而RCCC各分级各分期的肿瘤细胞均可脱落至外周血中被检测到，它与肿瘤浸润深度和能力没有直接关系。针对RCCC中Survivin mRNA高表达的特性，可能将Survivin mRNA作为RCCC生物治疗的新靶点，抑制肿瘤细胞的发生和发展，从而可能为RCCC的辅助治疗提供一条新的思路。

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