血清甲状腺激素(T3、T4)的磁酶联免疫测定法——方法学探讨及临床应用

【摘要】 本技术为酶联免疫系统与磁性微粒分离技术相结合的一种测定血清T3、T4的方法，并使用了一种高亲合力的抗体。血清中的T3、T4与一定量的荧光素T3、T4衍生物竞争性地和少量酶标T3、T4单克隆抗体相结合，并使用了ANS置换剂，把T3、T4从蛋白质中置换出来。方法学检测数据如下：最小检出量T3为0.2ng／mL，T4为5.0ng／mL；回收率：T3为1.03，T4为0.98；批内变异系数T3为3.5％，T4为5.1％；批间变异系数T3为4.6％，T4为5.1％；两种抗血清对相应抗原的同类物的交叉反应率低，用本方法与放免法同时测定30份标本，同一激素的两种方法测定结果呈显著相关。
【关键词】 甲状腺激素 磁酶联免疫测定
　　近年来，经过科研工作者的努力，先后建立并发展了多种使用非放射性标记物的免疫测定法，其中包括磁分离酶联免疫测定法(MAIA)。国内外关于人血清T3和T4的MAIA的论著已有多篇，我们于1995年来对本院多例病人和正常人进行了血清中的T3、T4测定，其中30份病人标本同时用放免法(RIA)作对照，兹将结果报告如下。
　　1 材料和方法
　　1.1材料
　　本实验使用的是北京倍爱康生物技术有限公司提供的T3、T4试剂盒。
　　(1)抗T3、(T4)衍生物1瓶：牛碱性磷酸酶标鼠抗T3、(T4)单克隆抗体的Tris缓冲液；羊和牛的血清蛋白；叠氮化纳0.2％W/V，20mL。
　　(2)T3、(T4)、衍生物1瓶：荧光素标T3、(T4)、衍生物的Tris缓冲液；羊、牛血清蛋白；0.19％ W/V ANS：0.2％W/V叠氮化纳，20mL。
　　(3)分离剂(0.6％)1瓶：与磁性微粒共价结合的羊抗荧光素抗血清0.6％W/V的Tris缓冲液：0.5％W/V牛血清蛋白；0.2％W／V叠氮化钠，40mL。
　　(4)清洗浓缩液1瓶：表面活性剂和防腐剂的Tris缓冲液，14．3mL。
　　(5)基质2瓶：为单磷酸酚肽(PMP)，辅酶的缓冲液15．0mL。
　　(6)终止液1瓶：氢氧化钠与螯合物的缓冲液100mL，pH>10。
　　(7)对照液1瓶：冻干人血清，0．01％W／V硫汞散复制后为1mL。
　　(8)标准液各6瓶：T3盒内含0，0.5，1.0，2.5，5.0，10．0ng/mL的T3人血清溶液；0.2％W／V叠氮化合物1mL；T4盒内含0，20，40，80，150，300ng／mL的T4人血清；0.2％W／V叠氮化合物，0.7mL。
　　1.2标本采集
　　取5．0mL静脉血至玻璃试管，不加添加剂，在室温中凝结，离心，取血清部分。
　　1.3测定方法
　　每份标本均做双份测定。将T3、T4清洗液稀释至100mL，对照液加蒸馏水1mL稀释，测定时按表1顺序加液至12×60nm塑料试管中。加液毕，37℃水温孵育15分钟，加入过量与磁性微粒结合的抗荧光素抗体，它快速、特异地结合成T3、T4单克隆抗体复合物，不用离心，就能在磁场中沉淀，洗涤2次，滤干，向试管内加入60mL PMP．37℃水温孵育15分钟，加入200mL终止液、显色，上架沉淀10分钟，在SEROZYME-I型内分泌定量测定仪上用492nm／550nm／630nm波长读取吸光度(OD)值。
　　2 结果
　　(1)标准曲线，从零标准管的OD值减去空白管的OD值得A值，从各标准管的OD值减去空白管的OD值得B值，以(B／A)％为纵座标，各标准管的T3(T4)标准液浓度为横座标，即可绘出T3(T4)测定的标准曲线。同样计算各标本管的B／A值，从标准曲线查出相应浓度。用本法做出的标准曲线T3的可测范围为0．3～10.0ng/mL，T4为6.0～300ng/mL。
　　(2)最小检测量(灵敏度)：根据实验的标准曲线计算，本方法测T3的最小检测量为0.2ng/mL，T4为5.0ng/mL。
　　(3)批内变异系数：同一标本进行20次测定，批内变异系数T3为2.7％～3.5％，T4为2.0％～4.3％。 　　 (4)批间变异系数：将标准曲线范围内几个不同浓度的标本，分别用20盒不同批号的试剂检测，批间变异系数T3为4．6％，T4为5.1％。
　　(5)将20份已知T3(T4)浓度的血清中加入不同浓度的T3(T4)标准液，测定结果按下列公式计算回收率：
　　(6)特异性：标本内加入不同浓度的IgE、hCG后，检测出来的结果表明本方法无交叉反应。
　　(7)稳定性：清洗液加蒸馏水或去离子水稀释后，2～8℃可贮存到失效，终止液在2～8℃或室温下，pH值不改变。衍生物，抗体在室温内放置2小时，并在1天内使用，测定结果无明显差异。
　　(8)MAIA与RIA的比较：用本法和本院建立的RIA法同时测定30份血清标本，包括高值，低值及正常值，以RIA测定值对MAIA测定值作图，经相关分析后得出如下结果，T3:y=0．98x-0.81，r=0.980，P<0.01；T4：y=1.0x-13.53，r=0.989，P<0.001。
　　(9)临床应用：以测定的多例正常人及病人血样为例，，可见正常值与高、低值之间有明显差异。
　　3 讨论
　　本方法是酶联免疫系统与磁性微粒分离技术相结合的一种测定方法，并使用了一种高亲合力的抗体。标本、对照液和标准液中的T3(T4)与一定量的荧光素标T3(T4)衍生物竞争性的与少量酶标T3(T4)单克隆抗体相结合。本法还使用了ANS为置换剂。在实验中我们观察到酶联物在-20℃保存时，酶会很快失活，无论是缓慢或快速融化均不能使其活性恢复，此种现象尚未见报道，原因有待证实。而本试剂酶标免疫试剂不需包被，随时可用，4℃保存可达6个月，免疫活性不变，液相快速反应，能扩展测试量程且具有很高的灵敏性，液态基质非常稳定，试剂反应结果为桃红色，肉眼可见，颜色稳定，可维持几天，整个实验过程尚未发现酶活性下降。
　　此法标本用量少，检验速度快，1～2小时内完成测定全部检测步骤，满足医生和病人即刻出结果的要求。实验中T3及T4的最小检测量同RIA水平比较，本法测定的血清T3、T4值略高于用RIA所得结果，但无显著差异。因比较的标本数量较少，尚难做最后确定，但正常值与病理值均值之间无交叉，测定范围之间没有重叠。
　　综合本实验结果可见，磁酶联免疫测定血清T3、T4含量，其灵敏度高，批内变异、批间变异、回收率、稳定性已达到或超过RIA的水平，且MAIA操作简单，无放射性核素污染问题，不需高价计数器，将具有更广阔的应用前景。
参 考 文 献
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