病证结合动物模型的制作、评价与展望

【摘要】 从病证结合动物模型的制备和评价两个大方面，对病证结合模型的研究进展进行综述。对病证结合模型的研究意义；模型制备中，病证种类的选择，造模动物的选择，造模因素的选择等环节；模型评价中的评价方法和标准等方面分别进行了阐述。指出病证结合模型研究中存在的问题，并提出相应建议。

【关键词】 病证结合模型；模型制备；评价方法

　　Abstract：This article summarized the study progress in two main aspects of establishment and evaluation methods of integration of disease and syndrome animal models，elaborated the significance of the research of integration of disease and syndrome animal models; the selection of Chinese medicine syndromes，the dieases，the animals for making models，and the facts for making models.Manifest the methods and standards for evaluating the models.Meanwhile point out the problems and give some ideas on the direction of research in the future.

　　Key words：integration of disease and syndrome model; establishment method; evaluation criterion

　　“病证结合” 动物模型既有西医疾病的特点，又有中医证候的特征，它将有助于中药药理学研究和中药药效的评价，有利于更全面、客观地认识中药的科学内涵，对于探讨疾病病理生理变化与中医证候特征之间的关系，更是显示出较大的优势。近年来，围绕证候本质，从临床研究到动物实验，从寻求单一的“证”的特异性指标到病证结合研究某一病证的客观指标，积累了丰富的研究资料，但同时也存在许多问题。现将病证结合模型的研究进展综述如下。

　　1 病证结合模型的制备

　　1.1 病证种类的选择

　　选择研究的疾病与证候应具有密切的关联性，也应具有发展阶段的同步性，易于找出两者在临床上的结合点，比如发现冠心病与血瘀证的密切联系，肾虚与骨关节疾病联系密切等。“病”与“证”是不同医学体系中的两个概念，是分别从不同角度对疾病的认识，“辨证”是中医的优势，“辨病”是西医的特长。病证结合动物模型就是在制作动物模型时，同时考虑病、证制作出的动物模型，如冠心病血瘀证动物模型［2］、高血压病肾阴虚证动物模型［3］、溃疡病脾虚证动物模型［4］等。

　　1.2 造模用动物的选择

　　病证结合动物模型所用的造模动物既要满足对造模药物敏感、模型特征出现迅速、持续和稳定的要求，又要满足易于造成所要研究的疾病和相应证候特征的要求［5］。
　　
　　不同品系、不同性别的实验动物对造模因素的耐受程度和敏感度不同，所以同等强度的造模因素作用于不同种系、不同生长阶段的动物上所表现出来的造模效果也是不相同的。另外，人和实验动物宏观和微观的疾病变化规律也不完全一致。要找与人体组织器官相似的动物来复制模型，或者是某个系统，甚至是某个器官相似的动物用作造模动物。最好是找宏观、微观变化规律都相似的动物。例如弗氏完全佐剂和II型胶原诱导的类风湿性关节炎模型，根据动物易感程度的不同，前者造模常用Wistar大鼠，后者用DBA —/1、N FR/N、B 10.G近交系小鼠［6］。又如许文玉等制作冠心病血瘀证动物模型，选用中华小型猪作为模型动物，因实验小型猪的心脏解剖结构及侧枝循环与人类相似；被毛稀少，皮肤组织结构和人最相似，便于观察皮肤变化；还可按中医辨证施治要求作舌诊观察，用相机记录病程中舌象的变化；多次反复大量采取血液和其他体液，便于动态观察血液流变学和其他生化指标［7］。

　　1.3 造模因素的选择

　　目前病证结合模型的造模多采用西医病理造模因素叠加中医证候造模因素的方法。另外也有使用单一物理或化学因素造成病证结合模型的方法。

　　1.3.1 证候造模因素疾病造模因素相叠加

　　根据中医病因病机理论，使用物理因素制造中医证候模型，叠加药物因素制造西医病理模型：如梁俊清等［8］以Wistar大鼠为实验动物，采用高同型半胱氨酸血症诱发血管内皮功能障碍为基础病理模型，叠加“基础进食和强迫负重游泳”诱发气虚证候，制作络气虚滞型血管内皮功能障碍动物模型。又如徐珊等［9］采用CCl4注射法复制肝硬化疾病模型叠加大黄灌胃法、游泳疲劳法制备肝纤维化肝脾虚病证结合模型。

　　陈天娥等［10］研究制作“大鼠脾气虚胃溃疡证病结合模型”，麻醉动物，暴露胃窦部，将0.02mL 50 %冰醋酸注入黏膜下层，然后逐层缝合切口，手术后采用的耗气破气加饮食失节法连续14d，造成脾气虚模型。李冀等［11］用大黄法、饮食失节法叠加乙酸涂抹法复制脾虚胃溃疡大鼠病证结合模型。西医病理因素或化学药物叠加制作病证结合模型：如韩清民等［12］使用SD雌性大鼠双侧卵集切除去势结合单侧膝前后交叉韧带、内侧副韧带切断的方法复制肾虚型骨性关节炎模型。梁爱华等［13］用细菌内毒素与角叉菜胶两种因素叠加，制作血瘀证和血栓形成病证结合动物模型。西医病理因素造或化学药物中医证候模型，叠加药物或病理因素造西医疾病模型：如徐世杰等［14］用切除小鼠卵巢叠加Ⅱ型胶原皮下注射以诱导关节炎的的方法制备小鼠肾阳虚型免疫性关节炎病证结合模型［15］。

　　1.3.2 单一因素制作病证结合模型

　　单一病理因素制备病证结合模型，即使用单一病理因素作为病证结合模型疾病与证候共同的造模因素。如刘蕾等［16］采用对中华小型猪施行冠脉Ameroid环缩术的方法，制作心肌缺血血瘀证小型猪模型。

　　单一药物因素制备病证结合模型，即使用单一病理因素作为病证结合模型疾病与证候共同的造模因素。如杨宇飞等［17］以腹腔注射促红细胞生成素腹腔注射的方法造成继发性红细胞增多症动物模型，该模型既符合继发性红细胞增多症疾病模型，又符合中医血瘀证模型，为病证结合模型。又如裴妙荣等［18］采用Wistarda大鼠每日0.1 % 丙基硫氧嘧啶（PTU） 灌胃（用生理盐水配成0.1 %的溶液），给药剂量 1mL/ 100g的方法，制备大鼠肾阳虚型甲状腺功能减退症病证结合模型。这种使用单一造模手段制作病证结合模型的造模方法，文献报道并不多见，但是由于其造模因素单一，可控性相对较强，其针对一些特殊的病证，如心肌缺血血瘀证，不失为一种有效可行的方法［19］。

　　2 病证结合模型的评价

　　2.1 从中医证候的角度考虑

　　首先，在人的证候诊断标准基础上，注重挖掘动物身上的具有诊断意义的信息特征，对模型进行恰当的辨证诊断。需要注意的是，这里有一个生物意义上相同指标的转换问题，即人与动物四诊的转换问题，需要进一步探讨。其次，将临床研究和基础研究中能够较客观地反映证候特征的微观指标，也移植到动物模型评价上［20］。以及借鉴四诊的客观化研究成果。如利用心电图反映动物的心脏情况［21］；根据动物的脱毛、抓取激惹、拱背蜷缩等程度不同进行半定量评分［22］。此外，可采用中药反佐证明的方法，对模型进行评价。如模型动物服用四君子汤后症状、体征和实验检测指标明显好转，并恢复正常，提示此模型为脾虚证［23］。

　　2.2 从病理生化角度考虑

　　疾病总会在机体代谢、机能及形态等方面表现出异常改变，疾病在发生发展过程中必然出现一些脏器组织的病变或血液组织液中某些特异性物质的变化。通过疾病发病机制的研究，可以掌握与疾病相关性大的一些生理生化成分。通过检测这些成分的变化，可以对疾病模型的造模进行评价。例如用于类风湿性关节炎研究的佐剂型关节炎大鼠模型，其特异性指标变化为：踝关节肿胀、炎细胞浸润、血管翳形成、软骨组织的破坏和骨侵蚀、血清中细胞坏死因子α和白介素Ιβ的含量显著增高等［24］。

　　2.3 从反映病证关联性的角度考虑

　　如代谢组学的方法，具备反映和解决证候问题的“组”、“群”、“谱”集成的分析功能，侧重于寻找相关特定组分的共性加以分析、判断。它能够通过检测不同时间的尿液或血液，对这些由疾病引起的代谢产物进行分析，有助于了解病变过程及机体内物质的代谢途径和代谢状况，还有助于疾病的生物标记物的发现，可以提高诊断的科学化、定量化，避免了人为因素的干扰，为证候和疾病标准化的研究提供了一种可行的方法［25］。如王米渠等［26］用基因芯片的方法研究中医寒证患者，发现寒证的基因表达谱有显著差异，在59条差异表达基因中，绝大多数与代谢（能量代谢、蛋白质代谢等） 有关，说明寒证患者的代谢网络有别于常人。

　　3 展望

　　3.1 加强疾病的本质和中医证候物质基础的研究

　　要制作出比较理想的病证结合模型并形成比较合理的评价标准，我们应该关注于疾病和中医证候的物质基础研究。随着疾病发病机制研究以及中医证候研究的不断深入，我们掌握了越来越多的信息，这对我们进一步改进病证模型造模方法是很有帮助的。例如，研究表明血清Sa 抗体对类风湿性关节炎诊断的特异性为95.8 %，其有可能作为类风湿性关节炎动物模型的一个特异性指标用于模型评价［27］。又如，通过对中医证候本质的深入研究，观察到肝阳上亢证与植物神经功能及前列腺素代谢间的联系；血瘀证与血小板结构、功能、代谢间的联系；肝气郁结证与神经内分泌紊乱的联系［28］。沈自尹［29］从脏腑辨证思路着手，对“证”的研究通过“形见于外”探求“藏居于内”的本质，设立统一辨证标准，选择符合“形见于外”肾阳虚证而无其它证夹杂的典型患者，结果发现肾阳虚患者普遍有尿17羟皮质类固醇含量低下的现象。严惠芳等［30］选择临床慢性肾小球肾炎肾阴虚证和肾阳虚证患者为研究对象，检测其血清白细胞介素6、肿瘤坏死因子α的浓度。结果：三组间血清白细胞介素6、肿瘤坏死因子α浓度差异呈现为肾阴虚组> 肾阳虚组> 正常健康组，表明慢性肾炎均存在着不同程度的免疫功能紊乱。王立新［31］等人发现，肾阳虚模型动物的代谢网络明显偏离正常，而用温阳中药干预后，模型动物的代谢谱回归至正常范围，呈现网络修复的结果。这都为病证结合模型评价标准的制定和完善提供了依据和研究方向。

　　3.2 寻找中医证候与疾病病理状态关联性大的检测指标目前多数病证结合模型的造模及评价方法将证候和疾病人为分开，两套方法、两种标准整合在同一动物上。虽然这种评价方法现在是最常用的，也是有一定根据和理论支撑的，但是这种方法常常是证候指标和病理指标的简单相加，将病证结合模型中证候和疾病的关联性忽视了。应该重视病证的内在联系，充分利用各种研究手段，寻找中医证候与疾病病理状态关联性大的指标。在研究肾虚证与一些免疫系统疾病如类风湿性关节炎关系的过程中，有学者发现OPN（骨桥蛋白）是抗体诱导的关节炎发展过程中的关键分子之一，它参与类风湿关节炎、系统性红斑狼疮等多种自身免疫性疾病的发病机制，在骨质代谢及免疫系统中起双重作用，是沟通骨代谢和免疫之间的桥梁［32］。肾脏为表达 OPN 的主要器官之一［33］。肾虚证可以影响OPN的表达，这也可能是肾虚证可以加重免疫疾病症状的原因，是病证内在联系的关键点［34］。孙然［35］等发现SLE中医辨证分型与抗核抗体谱等免疫指标之间的内在联系。4种证型间ANA滴度按均值大小依次为风湿热痹证>瘀热痹阻症>阴虚内热证>脾肾阳虚证。抗dsDNA抗体异常按阳性率大小依次为风湿热痹>瘀热痹阻>阴虚内热>脾肾阳虚，提示ANA可作为SLE的筛选实验，抗dsDNA抗体可作为临床辨证的参考指标。

　　病证结合模型的研究，应从简单的外部造模手段的病、证结合，向病、证本质的内在联系发展。为研究现代医学疾病、中医证候的本质、中医药疗效以及中药新药开发等创造更好的条件。

参考文献

　［1］汤小虎 ，唐辉 ，陈学习.中医病证动物模型与中医理论的关系［J］.中华中医药学刊，2007，25（5）：994995.

　　［2］陈利国，胡小勤.论病证结合血瘀证血管内皮细胞损伤模型的建立［J］.中国中西医结合杂志，2007，27（3）：267269.

　　［3］屈会化，赵谈，曲荣波，等.自发性高血压大鼠早期中医证候的研究［J］.中医杂志，2008，49（5）：446448.

　　［4］刘声，郭霞珍.基于运气学说辨治慢性非特异性溃疡性结肠炎肝郁脾虚证临床观察［J］.中医药临床杂志，2009，21（4）：298300.

　　［5］支勇，曹式丽.阿霉素肾病动物模型的国外研究进展［J］.中国中西结合肾病杂志，2008，9（10）：933935.

　　［6］ 陈奇.中药药理研究方法学［M］.北京：人民卫生出版社，2006：176178.

　　［7］许文玉，王伟，郭淑贞，等.小型猪心肌缺血血瘀证动物模型的复制方法［J］.中西医结合学报，2008，6（4）：409413.

　　［8］梁俊清，孙士然，吴以岭，等.络气虚滞型血管内皮功能障碍病证结合动物模型的建立及通络方药干预研究［J］.山东中医药大学学报，2008，32（1）：5257.

　　［9］徐珊，包剑锋，周敏，等.肝纤维化病证结合模型的研制［J］.中国中医药科技，2009，16（2）：8183.

　　［10］陈天娥，王秀琴，孙海梅，等.大鼠脾气虚胃溃疡证病结合模型肠系膜淋巴结表达IL2的初步研究［J］.首都医科大学学报，2004，25（3）：302305.

　　［11］李冀，刘波，李莆媛.香砂六君子汤对脾虚胃溃疡证病结合模型大鼠的影响［J］.辽宁中医杂志，2008，35（4）：505506.

　　［12］韩清民，王跃辉，程慧，等.肾虚型骨性关节炎造模方法研究［J］.新中医，2008，40（3）：9092.

　　［13］梁爱华，丁晓霜，李文，等.血瘀证与血栓形成病证结合动物模型的研究［J］.中国中药杂志，2005，30（20）：16131616.

　　［14］徐世杰，吕爱平，王安民，等.卵巢切除所致肾虚对免疫性关节炎小鼠血清骨钙素和肿瘤坏死因子的影响［J］.中国中西结合杂志，1999，19（1）：3436.

　　［15］冼绍祥，欧明.肾阳虚型心力衰竭病证结合动物模型的建立和评价［J］.辽宁中医药大学学报，2007，9（1）：910.

　　［16］刘蕾，王伟，宋剑南，等.心肌缺血血瘀证小型猪模型差异蛋白质组学研究［J］.中华中医药杂志，2009，24（6）：716719.

　　［17］杨宇飞，马麟麟，许勇刚，等.继发性红细胞增多症血瘀证病证结合动物模型的建立及清血颗粒的活血化瘀作用［J］.中国中医基础医学杂志，2005，11（6）：446448.

　　［18］裴妙荣，王晓英.用甲状腺功能减退症大鼠确立脾肾阳虚证之病证结合模型的探讨［J］.世界中西医结合杂志，2007，2（5）：299301.

　　［19］苗明三，张玉林，杨保新.病证方结合研究的思路［J］.时珍国医国药，2008，19（1）：9596.

　　［20］田松，雷晓明.中医证候动物模型研究现状的思考［J］.天津中医药，2004，21（3）：188190.

　　［21］刘蕾，郭淑贞，王伟.中医证候研究的现状及发展趋势［J］.中华中医药，2008，23（8）：661663.

　　［22］肖芸，方肇勤.中医证候动物模型的研究进展［J］.内蒙古中医药，2008，5：6466.

　　［23］刘建勋，李欣志，任建勋.中医证候模型拟临床研究概念的形成及应用［J］.中国中药杂志，2008，33（14）：17721775.

　　［24］顾强荣，王黎明，徐燕，等.99TcMDP治疗大鼠佐剂型关节炎的实验研究［J］.医学研究生学报，2008，21（2）：141144.

　　［25］谢毅强，牛乾.代谢组学与中医基础理论的研究进展［J］.医学综述，2008，14（4）：533535.

　　［26］王米渠，冯韧，严石林，等.基因表达谱芯片与中医寒证的7类相关基因［J］.中医杂志，2003，44（4）：288289.

　　［27］马丽国，徐兴伟.类风湿性关节炎患者血清抗SA抗体的测定［J］.黑龙江医学，2008，23（1）：5051.

　　［28］吴敏，吴勉华.分子生物学技术与中医病证相关性研究［J］.中医杂志，2002，43（1）：810.

　　［29］沈自尹.有关证与神经内分泌免疫网络的研究［J］.中医药学刊，2003，21（1）：104.

　　［30］严惠芳，张卫娜，孔月晴.慢性肾炎肾阴虚证与IL6TNFα相关性的临床观察［J］.中医药学刊，2005，23（7）：11971198.

　　［31］王立新，杨霓芝，张再康，等.应用代谢组学技术研究中医证候的思路［J］.广州中医药大学学报，2008，25（4）：366367.

　　［32］张鸽，吴玉林.骨桥蛋白在类风湿关节炎发病机理中的研究进展［J］.中国临床药理学与治疗学，2007，12（5）：488492.

　　［33］安娜，刘惠兰.糖尿病肾病肾小管间质损害的研究进展［J］.中华实用医药杂志，2006，6（22）：20422046.

　　［34］夏丽娟，陈飞虎，黄学应，等.重组人内抑素对佐剂性关节炎大鼠滑膜组织血管内皮细胞生长因子表达的影响［J］.中国临床药理学与治疗学，2006，11：760763.

　　［35］孙然，刘学明.51例系统性红斑狼疮中医辨证分型与抗核抗体谱的关系［J］.吉林中医药，2005，25（10）：78.