bFGF在局灶性脑缺血再灌注大鼠肝脏中表达的分析

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　　　　　　　　 作者：李雅娜 孙研 李笑岩 蔡磊 高菲 王伟善

【摘要】 目的 研究碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)在局灶性脑缺血再灌注大鼠肝脏中的表达及其作用。方法 采用线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，术后48 h取其肝脏，观察bFGF在肝脏中的表达情况，设假手术组进行对照。结果 模型组大鼠肝脏中可见肝细胞水肿、体积增大，胞浆疏松化，部分肝细胞出现脂肪变性，肝血窦狭窄，门管区炎细胞增多；bFGF表达增高，主要表达在肝小叶中央静脉周围。结论 局灶性脑缺血再灌注后肝脏中bFGF出现上调。
【关键词】 脑缺血再灌注；肝脏；成纤维细胞生长因子；大鼠
　　【Abstract】 Objective To explore the expression and effect of the bFGF in liver after focal cerebral ischemia reperfusion in rats.Methods Focal cerebral ischemia and reperfusion rat model was established with left middle cerebral artery occlusion by using thread inserting. Reperfusion was given to the rats after 2 hours ischemia. After 48 hours of the operation， the samples were taken out and processed for pathological changes of liver tissue by light microscopy. The expression of bFGF was analysed by immunohistochemistry and compared with sham operation. Results The liver cells in model group were hydropic degeneration. Some of the liver cells occurred fatty changed and inflammatory cells infiltrated of the portal areas. The hepatic sinusoid became narrower than Shamoperated group. The expression of bFGF was higher in model group than that in Shamoperated group.Conclusion The study indicated that bFGF was upregulated， which possibly could promote liver tissue repair after cerebral ischemia reperfusion.
　　【Key words】 cerebral ischemia，reperfusion，liver，bFGF，rats
　　组织或器官在一定时间缺血缺氧后会造成损伤，血供恢复后损伤会进一步加重称为缺血再灌注损伤（IRI），其中脑缺血再灌注损伤最为常见。脑缺血再灌注损伤是一个复杂的病理生理过程，除导致脑组织病变外，机体多脏器可同时受累，肝脏作为最易受累的器官之一，在临床和实验中受到人们的高度重视，但其机制还不完全清楚［１，２］。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是一种具有肝素结合特性的肽类细胞生长因子，广泛分布于各种正常组织和器官，研究发现脑缺血再灌注后脑组织中bFGF表达增高，对损伤具有一定修复作用，但有关bFGF在脑缺血再灌注后肝组织中的表达，尚未报道［３］。本研究采用线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，探讨bFGF在脑缺血再灌注大鼠肝脏中的表达及其作用，从而为临床预防和治疗脑缺血再灌注后肝脏损伤提供实验依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠32只，体质量280～320 g，由山东大学动物中心提供（许可证号:scxk鲁20030004）。
　　1.2 主要试剂 抗bFGF单克隆抗体购于CHEMICON公司，PV6001免疫组化检测试剂盒、内源性过氧化物酶阻断剂、DAB显色试剂盒均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。
　　1.3 大鼠MCAO模型的建立 参照Koizumi等［４］线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型。取直径为0.2　mm、长5　cm的尼龙渔线，一端近火将其烧成直径为0.24　mm的球形，使之变成规格一致、头端光滑的栓线，在距栓线头端18　mm、28　mm的位置以记号笔标记。使用前依次用75%乙醇、肝素钠注射液浸泡。大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛(1ml/100g)麻醉后，将其仰卧于手术台上，固定四肢及头部，垫高颈部，取颈部正中切口2　cm，显露左侧胸锁乳突肌，钝性分离左侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，结扎颈总动脉近心端，并于此结扎线的上方穿线备用，注意避免损伤迷走神经，再结扎颈外动脉，以动脉夹暂时夹闭颈总动脉分叉处，在距动脉夹约1　cm的近心端剪一“V”形小口，将栓线插入，栓线到达动脉夹处时以备用线将其扎住以免滑脱。向外侧轻拉颈外动脉结扎线，栓线沿内上方角度插入，以便顺利进入颈内动脉，避免误入翼腭动脉。栓线前端到达大脑前动脉处遇阻力时止，提示线已阻塞大脑中动脉，此时所做的第一个标记到达颈外动脉和颈内动脉分叉处，第二个标记到达“V”形切口处。剪断多余的结扎线，缝合切口，缺血2　h后轻拔栓线皮肤外的残端，至有阻力时提示线的头端已至颈外动脉，拔出约0.5　cm，实现再灌注。术中及术后环境温度调节在25～30℃左右，密切注意生命体征。
　　1.4 动物筛选 大鼠麻醉清醒后按Longa等［５］5分制方法进行神经功能评分。0分：无神经损伤症状，活动正常；1分：轻微神经功能缺损，不能完全伸展右侧前肢；2分：中度局灶性神经功能缺损，行走时向右侧转圈；3分：重度局灶性神经功能缺损，行走时向右侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。其中得分在1～3分者被认为模型制作成功，纳入实验。并设假手术组，仅模拟手术，不阻塞大脑中动脉，每组各10只大鼠。
　　1.5 肝组织病理学观察 术后48 h，大鼠以3.5%水合氯醛麻醉后，解剖分离肝脏，生理盐水冲净，浸入4%多聚甲醛溶液中固定12　h，修整组织块，PBS冲洗6　h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，5　μm厚度切片，行HE染色，光镜下观察其组织病理学改变。
　　1.6 免疫组织化学染色 石蜡切片常规脱蜡至水，3%过氧化氢溶液37℃ 30 min，蒸馏水冲洗后微波修复；PBS漂洗3次，滴加10%山羊血清封闭液，37℃孵育30　min；滴加兔抗bFGF单克隆抗体(1∶400)，4℃孵育过夜；PBS漂洗3次，滴加生物素化羊抗兔IgG(1∶200)，37℃孵育30　min；PBS漂洗3次，DAB显色液显色5　min；苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜观察。阴性对照以PBS代替一抗，其余步骤相同。
　　2 结果
　　2.1 MCAO模型组大鼠生理行为及脑组织变化 MCAO模型组大鼠出现左侧Horner’s征阳性(即左侧眼球下陷，眼裂变小)，不能伸右前肢；提尾时，右前肢内收屈曲，头弯向右上；右侧肢体肌力下降，严重者行走时向右侧转圈，出现不同程度的运动功能障碍。断头取脑后可见左侧大脑半球水肿明显，经TTC染色，可见左侧大脑顶叶皮层、部分额叶皮层和基底节呈现白色，为梗死部位，其余部位染成鲜红色，假手术组未出现白色梗死灶(见图1、2)。
　　2.2 MCAO模型组大鼠肝组织形态学变化 低倍镜下可见模型组和假手术组肝小叶均正常，肝细胞呈条索状，围绕小叶中央静脉放射状排列；MCAO模型组大鼠肝细胞水肿，胞浆疏松化，组织切片染色变浅，同时肝血窦、门管区变窄。高倍镜下可见肝细胞由于水肿而体积增大，形状变圆，边缘模糊略呈气球状，部分细胞胞浆内可见空泡样脂肪变性，同时在肝血窦和门管区可见炎性细胞浸润(见图3、4)。
　　2.3 bFGF在MCAO模型组大鼠肝组织中的表达 假手术组大鼠肝组织中bFGF表达较少，仅在肝小叶中央静脉周围部分肝细胞胞浆内出现棕黄色淡染颗粒。模型组大鼠bFGF呈阳性表达，阳性细胞数较假手术组显著增高，肝细胞胞浆内可见棕黄色、粗大颗粒，细胞核及肝血窦内皮细胞亦见有阳性表达；阳性细胞在分布上呈现一定规律，肝小叶中央静脉处较多，向小叶周边呈递减趋势，肝门管区阳性细胞较少或未见阳性表达(见图5、6)。
　　3 讨论
　　缺血再灌注损伤(IRI)是造成术后肝功能衰竭的重要原因之一，而碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在缺血再灌注肝损伤中的作用并不清楚，相关的报道也较少，于是我们采用线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，旨在研究bFGF在大鼠局灶性脑缺血再灌注后肝脏损伤中的作用，从而为临床预防和治疗脑缺血再灌注后肝脏损伤提供实验依据。
　　3.1 脑缺血再灌注模型的选择 大鼠脑缺血模型是研究脑血管损伤机理和防治措施的常用动物模型。大鼠脑血管的解剖和生理功能与人类相似，而且血管变异小、梗死部位相对容易控制、实验重复性好，能很好地模拟人类急性脑缺血的病理生理过程。大脑中动脉区是人类脑梗死的好发部位，因此大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型被普遍认为是局灶性脑缺血的理想动物模型［６，７］。线栓法制备局灶性脑缺血再灌注动物模型的机制是依靠栓线的前端阻塞大脑前动脉根部，阻止经大脑前动脉反流的血液；依靠栓线的侧壁阻塞颈内动脉和后交通支的血流，从而使该侧大脑中动脉的血液完全中断，根据研究需要确定缺血时间，拔除栓线可以使血管复通实现再灌注。此法具有不开颅、创伤小、不影响缺血性脑水肿及颅内压病理变化的自然过程，可准确控制缺血及再灌注时间，操作亦较简单等优点［８］。因此，本实验采用此法制备MCAO模型大鼠，能较好地模拟临床疾病。
　　3.2 脑缺血再灌注后对肝脏的影响 本实验研究发现，急性局灶性脑缺血再灌注后大鼠肝组织出现损伤，主要表现为肝细胞水肿、体积增大、胞浆疏松化、部分肝细胞胞浆内出现空泡样脂肪变性，肝血窦、门管区变窄，可见大量炎性细胞浸润。肝细胞这些病理变化表明肝细胞处于缺能状态，研究证实是由于肝细胞线粒体发生异常改变导致，质膜上的离子泵失灵，钠水进入肝细胞引起细胞肿胀。肝脏是机体能量代谢的重要器官，具有多种细胞器，其中线粒体是能量的供应站，是氧化磷酸化产生ATP的场所，肝脏损伤时，线粒体的改变最为突出［９］。因此，还需进一步在电镜下研究MCAO模型大鼠肝脏线粒体的改变对肝脏损伤的影响。

3.3 bFGF在脑缺血再灌注后肝组织中的表达 bFGF在体内分布广泛，具有多种生物学功能，如促血管形成、诱导胚胎发育，参与伤口愈合、组织修复、神经组织生长和再生、动脉粥样硬化的斑块形成等许多病理生理过程，在肿瘤的发生、发展和转移过程中起着重要作用。在正常肝组织中的bFGF呈弱阳性表达，主要分布于肝细胞及肝窦内皮细胞中，是一种促进细胞有丝分裂的诱导因子，在血管发生中起重要作用［１０］。肝纤维化时bFGF主要见于纤维间隔区、门管区、肝窦内皮细胞、肝细胞、纤维母细胞、小胆管及再生肝细胞等，而肝窦内皮细胞、成肌纤维样细胞、血管内皮及平滑肌细胞和肝细胞是bFGF分泌的主要细胞，研究发现，随着肝细胞变性坏死的加重，肝组织bFGF表达明显增强，尤其在炎症坏死区表达较显著［１１］。近年来研究表明，bFGF对部分正常细胞具有转化作用，与肿瘤的发生发展及转移有密切关系。原发性肝癌组织中bFGF的表达主要位于胞浆，而且bFGF的表达与原发性肝癌的大小、病理分级、有无包膜、HBsAg及AFP无明显关系。据报道，bFGF在原发性肝癌的浸润和转移中发挥重要作用，提示bFGF与肝癌预后有关［１２］。
　　本研究显示脑缺血再灌注后大鼠肝组织中bFGF表达量增多，可能对肝脏起到保护组织、刺激细胞增殖分化、调控炎性反应、诱导毛细血管胚芽形成、减轻其水肿程度等，对肝组织损伤的修复起到促进作用，但其机制并不清楚。
　　综上所述，大鼠脑局灶性缺血再灌注后肝细胞出现水肿、胞浆疏松化、部分肝细胞出现脂肪变性等改变；肝脏中bFGF的表达有所增高，但机制及其对损伤肝组织的作用还需要进一步研究。
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