应用RTPCR浅析食管癌组织中lrig1基因的表达

　　　　　　　　　　 作者：闫尧　马军　唐芙爱　达嘎　祁秋干　李印

【摘要】 目的: 观察lrig1基因在食管鳞癌中的表达及意义. 方法: 采用RTPCR检测36例食管鳞状细胞癌癌组织、相应的癌旁组织和远癌组织中lrig1 mRNA的表达情况. PCR产物经凝胶电泳，比较3种组织中lrig1与GAPDH条带的灰度值之比，半定量分析lrig1 mRNA的表达水平. 结果: 36例食管癌组织中有15例(42%)lrig1 mRNA检测到阳性表达，21例(58%)lrig1 mRNA表达缺失，其阳性表达率低于相应的癌旁组织（92%）和远癌组织(100.0%，P&<0.05)；癌组织中lrig1 mRNA表达水平(0.76±0.22)低于相应的癌旁组织(0.89±0.33)和远癌组织(1.13±0.40)；随着肿瘤分化程度的升高，lrig1 mRNA在癌组织中的阳性表达率也增加(P&<0.05)，但lrig1 mRNA表达缺失与食管癌临床分期(TNM)，淋巴结有无转移和病理类型均无统计学差异(P&>0.05). 结论: lrig1 mRNA在食管癌组织中存在表达缺失和低表达，提示lrig1基因在食管癌的发生发展中可能具有抑癌基因的作用.
【关键词】 lrig1基因；食管肿瘤；mRNA；逆转录聚合酶链反应
　　【Abstract】 AIM: To study the expression of lrig1 gene in esophageal squamous cancer and its significance. METHODS: The expression of lrig1 gene was detected by RTPCR in cancer tissues， matched paracancer tissues and tissues far away from tumor in 36 cases of esophageal squamous cancer. PCR products were tested by gel electrophoresis.The expressions of lrig1 gene in the three kinds of tissues were semiquantified by calculating the ratio of the gray value of lrig1 bands and those of GAPDH bands respectively. RESULTS: The positive expression rate of lrig1 mRNA in 36 cases of esophageal carcinoma was 41.7% (15/36). The positive rate was lower than that in tumoradjacent tissues (91.7%) or esophageal mucosa far away from tumor(100.0%) respectively (P&<0.05). Semiquantified analysis showed that the level of lrig1 mRNA expression in esophageal cancer tissues (0.76±0.22) was lower than that in tumoradjacent tissues (0.89±0.33) and esophageal mucosa far away from tumor (1.13±0.40). The higher positive expression rate of lrig1 mRNA was correlated with higher differentiation grades in cancerous tissues (P&<0.05). While the expression of lrig1 mRNA had no relationship with TNM stages， lymph node metastasis or histologic types in esophageal cancer (P&>0.05). CONCLUSION: The expression of lrig1 mRNA is lost or reduced in esophageal cancer tissues， which indicates that the lrig1 gene may play an important role in suppressing the tumorigenesis and development in esophageal cancer.
　　【Keywords】 lrig1 gene; esophageal neoplasms; mRNA; RTPCR
　　0引言
　　人类lrig1基因，其位于人类染色体3p14.3，目前已有文献表明，lrig1基因是一个候选的抑癌基因，对其机制也有了初步的探索［1-6］. 我国是食管癌高发地区，对食管癌组织中lrig1基因的研究少见文献报道. 鉴于此，我们应用RTPCR检测lrig1基因在食管癌中的表达情况，并探讨lrig1基因在食管癌发生、发展中的意义.
　　1对象和方法
　　1.1对象
　　河南省肿瘤医院胸外科200603/200608行手术切除的食管癌住院患者36(男26，女10)例，年龄62.17±7.2(40～75)岁；术前均未接受化、放疗，肿瘤组织经病理学检查证实均为鳞状上皮细胞癌；临床分型：溃疡型21例(58%)，髓质型9例(25%)，蕈伞型5例(14%)，缩窄型1例(3%)；分化程度：高分化4例(11%)，中分化8例(22%)，低分化24例(67%)；肿瘤临床分期：按国际TNM分期(UICC，1997年)，I期4例(11%)，Ⅱ期15例(42%)，Ⅲ期17例(47%)，Ⅳ期0例；有淋巴结转移19例(53%)，无淋巴结转移17例(47%). TRIzol总RNA提取试剂及PCR试剂盒(北京TIANGEN公司)；反转录试剂盒(丹麦Fermentas公司)；PCR扩增仪(德国Eppendoff公司)；高速台式冷冻离心机(德国Eppendoff公司)；水平电泳仪(美国BioRad公司)；DBT08型凝胶成像分析仪(美国UVITEC公司).
　　1.2方法
　　1.2.1标本收集于手术中收集标本，取材后速冻于液氮中，后于-80℃超低温冰箱中贮存备用. 标本取材大小均约0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm；癌组织均在原发灶取材，避开坏死、炎症区域；癌旁组织取自相应肿块旁2 cm的食管黏膜组织；远癌组织均取自距肿块边缘5 cm以上的食管黏膜组织.
　　1.2.2引物设计lrig1基因引物用Oligo6.0软件设计，序列如下：上游5′CAG TGC ATA GCT GGA GGG AGT C3′；下游5′TAC AAT GAT GAG AAG CTG ATT GGC TGC A3′；扩增产物片段长度140 bp. 做为内参照的GAPDH基因引物根据Fort等［7］报道的序列设计：上游5′CAT CAC CAT CTT CCA GGA GCG3′，下游 5′TGA CCT TGC CCA CAG CCT TG3′，扩增产物片段长度443 bp. 以上引物均由上海生工生物技术有限公司合成.
　　1.2.3组织中总RNA的提取采用TRIzol试剂，按常规步骤提取总RNA. 总RNA以50 μL DEPC水溶解. 琼脂糖凝胶示5，18，28 s的3条清晰条带，再经紫外分光光度仪测定260 nm和280 nm的A值，取A260 nm/A280 nm比值为1.8~2.0者用于反转录反应.
　　1.2.4RTPCR扩增以提取的总RNA为模板，按试剂盒说明书进行操作. 反转录步骤如下：总RNA 8 μL，oligo(dT) 1 μL，无RNase水3 μL，混匀，离心. 70℃，5 min；立即置于冰浴，2 min. 加入5×Buffer 4 μL，RNase抑制剂1 μL，dNTP 2 μL，混匀，37℃，5 min；加入反转录酶1 μL，42℃，60 min；70℃，10 min；立即置于冰浴，合成cDNA第一链. 以cDNA为模板进行PCR扩增. 我们选择扩增的是lrig1基因及内参照GAPDH基因，引物序列见1.2.2. PCR扩增反应步骤如下：反应体积为25 μL，94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s；经36个循环周期后，72℃，5 min，取出，4℃贮存备用. PCR产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳（溴化乙锭染色）后，紫外透射反射仪下观察结果，并在凝胶成像仪上照相，扫描所得灰度值进行统计学分析. 以100 bp DNAMarker为标准，在140 bp位置出现条带为lrig1表达阳性；GAPDH在443 bp位置上出现条带为表达阳性.
　　统计学处理: lrig1 mRNA的表达水平以x±s表示，采用SPSS13.0统计分析软包分析，根据资料类型采用ANOVA， NewmanKeuls检验， χ2检验及Fishers Exact Test. 取P&<0.05为差异有统计学意义.
　　2结果
　　2.1RTPCR产物琼脂糖凝胶电泳lrig1及内参GAPDH的PCR产物琼脂糖凝胶电泳，其大小与预先设计引物大小一致(图1，2). 36例食管远癌组织中均有lrig1 mRNA阳性表达，癌旁组织中有33例(92%) lrig1 mRNA阳性表达，而食管肿瘤组织中有21例(58%)lrig1 mRNA表达缺失(图1)；15例(42%)lrig1 mRNA检测到阳性表达(图2).
　　2.2lrig1 mRNA在食管癌各组织中的表达情况食管癌组织中lrig1 mRNA阳性表达率为42%，而癌旁组织、远癌组织中分别为92%， 100%，经统计学分析，食管癌癌组织中lrig1 mRNA的阳性表达率低于癌旁组织（χ2=20.25，P&<0.05）和远癌组织(Fishers Exact Test，P=0.001)，而癌旁组织和远癌组织之间lrig1 mRNA的阳性表达率无统计学差异（Fishers Exact Test，P=0.12）；应用灰度扫描半定量分析，lrig1 mRNA在食管癌癌组织、癌旁组织及远癌组织中阳性表达水平分别是0.76±0.22， 0.89±0.33及1.13±0.40；经统计学分析，lrig1 mRNA在食管癌癌组织的阳性表达水平低于在癌旁组织（q=5.04，P&<0.05）和在远癌组织（q=9.38，P&<0.05）中的表达；且在癌旁组织中的表达也低于在远癌组织中的表达(q=7.15，P&<0.05).

转贴于 　　2.3lrig1 mRNA表达与食管癌临床病理特征之间的关系lrig1 mRNA在癌组织中阳性表达率为：Ｉ期50%(2/4)：Ⅱ期33%(5/15)，III期47%(8/17)，Ⅳ期0%(0/0)；低分化12%(3/24)，中分化100%(8/8)，高分化100%(4/4)；溃疡型43%(9/21)，髓质型33%(3/9)，蕈伞型60%例(3/5)，缩窄型0%(0/1)；有淋巴结转移组42%(8/19)，无淋巴结转移41%(7/17). 统计学分析表明：随着肿瘤细胞分化程度的升高，lrig1 mRNA在食管癌组织中的阳性表达率也逐渐增加，低分化组与中、高分化组比较有统计学差异(Fishers Exact Test， P低vs中=0.001； P低vs高=0.001)，而中、高分化组之间比较无统计学差异(Fishers Exact Test，P中vs高=1.00)；癌组织中lrig1 mRNA阳性表达率与食管癌病理类型、临床分期及有、无淋巴结转移均无统计学差异(P&>0.05).
　　3讨论
　　我们的研究表明，lrig1 mRNA在36例食管癌标本中仅有15例在癌组织中存在阳性表达，其阳性表达率显著低于癌旁组织及远癌组织(P&<0.05)，而后两者间的阳性表达率无统计学差异(P&<0.05)；通过半定量分析表明，lrig1 mRNA在肿瘤组织中的表达水平低于在癌旁组织及远癌组织(P&<0.05)，而且在远癌组织中的表达水平低于癌旁组织(P&<0.05)；另外，通过比较分析，lrig1 mRNA低表达或表达缺失，与食管癌细胞分化程度有显著性差异(P&<0.05). 分化程度越高，lrig1 mRNA的阳性表达率逐也越高，可能在食管癌的发生过程中与lrig1 基因抑癌作用逐渐失活有关；而与食管癌临床病理分期、淋巴结有无转移和病理类型均无显著性差异(P&>0.05). 因此，lrig1基因在食管癌组织中表达率减低和部分表达缺失，说明lrig1基因在食管癌发生发展中可能具有抑癌基因的作用，是可能的抑癌候选基因分子之一. 其抑癌作用机制尚不清楚，目前有学者［8-9］通过研究lrig1诱导神经胶质瘤细胞系H4的凋亡作用，认为lrig1是一个候选抑癌基因，并对其作用机制作了初步的探讨. 他们认为，lrig1通过参与形成EGFR的负反馈环抑制肿瘤生长. 但此看法仍处于假说阶段，须进一步的研究.
　　在肿瘤组织中表达下调的基因一般被认为是潜在的抑癌基因，表达上调的基因可能对肿瘤发生、发展起促进作用. 而我们的实验提示，lrig1 mRNA在食管癌组织中表达率减低和部分表达缺失，说明在食管癌发生发展中可能是由于lrig1基因失活而不能发挥抑制肿瘤的作用，进一步证实lrig1 基因在食管癌中可能是候选的抑癌基因. 迄今为止，人们对lrig1基因的了解十分有限，它的诸多功能、作用机制以及与相关基因的相互关系等许多方面还不十分清楚，有待于进一步深入研究.
基金项目：河南省医学科技创新人才工程项目（豫财社［2005］158号）
【

参考文献

】
　　［1］Hedman H， Nilsson J， Guo D， et al. Is lrig1 a tumor suppressor gene at ebromosome 3p14.3? ［J］. Acta Oncol， 2002， 41(4): 352-354.

　　［2］Suzuki Y， Miura H， Tanemura A， et al. Targeted disruption of LIG1 gene results in psoriasiform epidermal hyperplasia［J］. FEBS Lett， 2002， 521(13): 67-71.

　　［3］Thomasson M， Hedman H， Guo D， et al. lrig1 and epidermal growth factor receptor in renal cell carcinoma: A quantitative RTPCR and immunohistochemical analysis［J］.Br J Cancer，2003，89(7): 1285-1289.

　　［4］Holmlund C， Nilsson J， Guo D， et al. Characterization and tissuespecific expression of human lrig2 ［J］. Gene， 2004，332(5): 35-43.

　　［5］Guo D， Holmlund C， Henriksson R， et al. The lrig1 gene family has three vertebrate paralogs widely expressed in human and mouse tissues and a homolog in Ascidiacea［J］. Genomics， 2004， 84(1): 157-165.

　　［6］Tanemura A， Nagasawa T， Inui S， et al. lrig1 provides a novel prognostic predictor in squamous cell carcinoma of the skin: immunohistochemical analysis for 38 cases［J］. Dermatol Surg，2005，31(4): 423-430.

　　［7］Fort P， Marty L， Piechaczyk M. Various rat adult tissues express only one major mRNA species from the glyceraldehydes3phosphatedehydrogenate multigenic family［J］.Nucleic Acids Res， 1985，13(5):1431-1442.

　　［8］叶飞，郭东升，牛洪泉，等. lrig1 cDNA诱导人胶质瘤细胞系H4凋亡的分子机制［J］.癌症， 2004， 23(10): 1149-1154.

　　［9］Xiong Z， Cao Y， Guo D， et al. Expression of EGFR and lrig1 in human trigeminal neurinoma［J］. 华中科技大学学报医学版， 2006， 26(1):86-88.