[摘要] 目的 探讨氧化苦参碱（oxymatrine，OM）减轻四氯化碳诱导肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）的机制。 方法 建立四氯化碳诱导的大鼠HF模型，制备氧化苦参碱脂质体（Oxymatrine liposomes，OM-liposome）、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arginine-Glycin-Aspartic acid，RGD）三肽序列偶联的OM及异硫氰酸荧光素（fluorescent isothiocyanate，FITC）标记的OM-liposome和RGD-OM-liposome。分离HF大鼠的肝脏星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）并体外培养：①将OM-liposome、RGD-OM-liposome和RGD偶联的空白脂质体（RGD-liposome）作用于HSCs，利用透射电镜检测HSCs的细胞亚显微结构（凋亡小体）变化，利用流式细胞技术检测HSCs的细胞周期，利用台盼蓝染色检测HSCs的细胞活性。②将FITC-OM-liposome和FITC-RGD-OM-liposome作用于HSCs，利用荧光显微镜技术比较两种剂型OM在HSCs中的分布。 结果 ①与RGD-liposome比较，OM-liposome可促进HSCs凋亡小体形成，增加HSCs凋亡，降低HSCs的细胞活性；与OM-liposome比较，RGD-OM-liposome可进一步增加HSCs内凋亡小体，促进HSCs凋亡，降低HSCs活性。②RGD可促进OM-liposome在HSCs内的分布。 结论 OM-liposome可在体外诱导HSCs凋亡，RGD可促进OM-liposome在HSCs的分布，进一步促进HSCs的凋亡。诱导HSCs凋亡可能是OM减轻肝纤维化的重要机制。
[关键词] 氧化苦参碱；脂质体；精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸；肝纤维化；肝星状细胞
氧化苦参碱（oxymatrine，OM）是从传统中药豆根槐属植物苦参或豆科植物苦豆子、山根豆中提取的主要活性成分，是一种四环喹嗪啶类生物碱。近年来研究发现，氧化苦参碱对乙型肝炎、丙型肝炎、肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）及肝癌都具有较好的疗效[1]，作用机制目前尚不清楚。各种慢性肝损伤均可发展至HF，目前认为HF是对创伤的一个修复过程，在此损伤修复的反应中，细胞外基质（extracellular matrix，ECM）、肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）和细胞因子共同参与发挥了纤维化的作用[2]。越来越多的研究证实，HSCs的活化、增殖在HF的形成和发展过程中起着重要作用，抑制HSCs的活化及诱导HSCs的凋亡对有效控制肝纤维化起到至关重要的作用。研究证实，OM对其他器官组织损伤、纤维化[3]及肿瘤都有一定的治疗效果，其中，OM抑制细胞凋亡是其减轻胰腺癌的重要机制[4]。因此，笔者猜测OM抑制HSCs活化、诱导HSCs凋亡可能是其治疗HF的重要机制，现将研究报道如下：
1 材料与方法
1.1 实验动物与试剂
清洁级SD大鼠，体质量约200 g（第四军医大学），大豆卵磷脂（天津远航化学品有限公司），胆固醇（北京奥博星生物技术责任有限公司），甲醇（西安化学试剂厂），氯仿（西安化学试剂厂），98.9%氧化苦参碱（西安大河药业有限责任公司），异硫氰酸荧光素（FITC，陕西博微生物试剂公司），精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD） 序列（陕西博微生物试剂公司），碘化丙啶（PI，陕西博微生物试剂公司），胶原酶Ⅳ（美国Sigma公司），密度梯度离心介质Nycodenz（美国Sigma公司）， DMEM培养液（美国Gibco公司），小牛血清（美国Gibco公司），胰蛋白酶（美国Gibco公司）。
1.2 方法
1.2.1 制备氧化苦参碱脂质体（逆相蒸发法） 将大豆卵磷脂5.0 g、胆固醇2.5 g，溶于50 mL氯仿-甲醇混合液中，70℃水浴挥干溶剂，加入油酸0.5 g，聚山梨酯2.5 g，搅拌融化。另将氧化苦参碱1.5 g、聚乙烯吡咯烷酮2.5 g溶于pH 7.4磷酸缓冲液中，水浴加热至70℃。将两者混合，恒温搅拌，灌装，密封，超声乳化，所得乳剂在旋转蒸发仪上减压蒸除有机溶剂，然后再进行短时超声，即得乳白色氧化苦参碱脂质体（Oxymatrine liposomes，OM-liposome）。
1.2.2 制备精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸偶联的氧化苦参碱脂质体 按10∶1摩尔比加入RGD，室温震荡过夜，得到RGD修饰的氧化苦参碱脂质体（RGD-OM-liposome），冰浴下旋涡震荡30 min，通过凝胶柱（CL-4B），层析法除去未偶连的脂质体。
1.2.3 制备RGD偶联的脂质体 按照“1.2.1”中的方法制备脂质体（不加入氧化苦参碱），随后按照“1.2.2”中方法将RGD与脂质体偶联。[]
1.2.4 异硫氰酸荧光素标记药物 用分析天平准确称取所需的FITC，按100∶1比例缓慢加入于RGD-OM-liposome及OM-liposome中，不停地搅拌5～10 min，避免将荧光素黏于三角烧瓶壁或搅拌玻璃棒上，然后继续搅拌12～18 h后，溶液以2 500 r/min离心20 min，除去其中少量的沉淀物，装入透析袋中再置于烧杯中，于4℃冰箱中过夜，得到FITC-RGD-OM-liposome及FITC-OM-liposome。
1.2.5 动物模型的制备和肝星状细胞的分离、培养[5] 雄性SD大鼠，体重约200 g，食用标准饲料，饮自来水。四氯化碳肝纤维化模型制备：8 周末，腹腔麻醉大鼠，皮肤消毒后切开，充分暴露肝脏，门静脉插管，同时剪开下腔静脉，用含肝素12 500 U的D-Hank's液灌注，待肝脏变为黄白色时，灌以0.05%Ⅳ型胶原酶消化，约40 min肝组织完全软化后，停止灌注，离体肝脏并剪碎，以尼龙网过滤，D-Hank's液冲洗，将滤过的细胞悬液移入50 mL离心管，吸管吹打，离心（450 g，5 min），弃上清，以D-Hank's液重悬，混以Nycodenz液，吸管吹打，转至离心管，并覆以D-Hank's液离心（1 450 g，16 min），取界面细胞，用DMEM重悬，再离心（500 g，7 min），弃上清，收集细胞。将刚分离的重悬细胞接种于培养瓶，在5% CO2，37℃，95%潮湿空气的CO2培养箱里培养48 h后，换10%小牛血清，3 d后首次换液，以后视情况每2～3天换液1次。
胞密度为5× l05/mL，待贴壁后，以0.25% FBS-DMEM培养，95%潮湿空气的CO2培养箱里过夜，实验前弃去原培养液，荧光显微镜观察药物在HSCs内的分布。
1.2.7 细胞活性检测 细胞经消化后，反复吹打使其成为细胞悬液，稀释到细胞浓度为106/mL，吸取约1 mL细胞悬液至离心管中，加入1滴台盼蓝并轻轻摇匀，在约3 min内对所有细胞进行计数。死细胞被台盼蓝染成蓝色，而活细胞则为无色，并根据公式计算活细胞率：活细胞率=（活细胞数/细胞总数）×100%。
1.2.8 实验分组 将生长良好的HSCs用0.25%的胰蛋白酶消化后，接种于24 孔培养板中，细胞浓度为2×107个/孔，每8个孔中分别加入0.5 mg/mL RGD-OM-liposome；OM-liposome以及RGD修饰的空白脂脂质体（RGD-liposome），并设对照组。
1.2.9 流式细胞仪分析HSCs凋亡情况 各剂型药物作用24 h后，细胞以胰酶消化，PBS清洗，将细胞悬液离心（800～1 000 r/min，5 min），弃上清液，加1 mL PBS，缓慢加入-20℃预冷的95%乙醇15 mL，使其终浓度为70%，冰浴30 min，4℃过夜；加入等量PBS 再洗2次，65 mg /L碘化丙啶（PI）避光， 4℃显色1 h，流式细胞仪检测。
1.2.10 电镜观察HSCs形态 取对数生长期的单层生长细胞，弃去瓶中培养液，用胰蛋白酶消化，将细胞移入10 mL离心管中，加4℃预冷的PBS至10 mL，吹打均匀，离心（2 000 r/min，15 min）弃上清，加入4℃预冷的2%戊二醛4 mL，4℃固定2 h，PBS漂洗3次，每次10 min，1%四氧化锇4℃固定30 min，PBS漂洗3次，用50%丙酮溶液室温下脱水10 min，弃脱水剂，加3 mL包埋剂包埋（按体积1∶1），室温下静置30 min，弃去包埋剂，加纯包埋剂1 mL，室温过夜后，将明胶注满混合包埋剂，60℃烤箱烘烤24 h，使标本固化为硬块，切片后电镜下观察细胞形态。
2 结果
2.1 各组凋亡小体形成情况
将模型大鼠肝组织中分离获得的HSCs在体外培养，分别加入RGD-liposome、OM-liposome和RGD-OM-liposome，利用透射电镜观察HSCs胞内凋亡小体的形成。结果发现，OM-liposome可促进HSCs胞内凋亡小体的形成；RGD则可进一步增加OM-liposome诱导HSCs凋亡小体形成的作用（图1）。
2.2 各组凋亡情况比较
将模型大鼠肝组织中分离获得的HSCs在体外培养，分别加入RGD-liposome、OM-liposome和RGD-OM-liposome，利用流式细胞技术检测HSCs细胞凋亡情况。结果发现，OM-liposome可诱导HSCs凋亡，抑制DNA合成；RGD则可进一步增加OM-liposome诱导HSCs凋亡、抑制DNA合成的作用（图2）。
2.3 各组细胞活性观察
将模型大鼠肝组织中分离获得的HSCs在体外培养，分别加入RGD-liposome、OM-liposome和RGD-OM-liposome，利用台盼蓝染色检测细胞活性。结果发现，随着浓度的不断升高，OM-liposome可显著抑制HSCs的细胞活性；RGD则可增强OM-liposome抑制HSCs细胞活性的作用（图3）。
2.4 OM-liposome和RGD-OM-liposome在HSCs中的分布情况观察
将模型大鼠肝组织中分离获得的HSCs在体外培养，分别加入FITC-RGD-OM-liposome和FITC-OM-liposome，利用荧光显微镜观察。结果发现，RGD可显著增加OM-liposome在HSCs中的分布（图4）。
3 讨论
OM对肝纤维化具有较好的疗效[1]，然而其机制尚不清楚。HSCs和细胞因子共同参与发挥了致肝纤维化的作用[2]。越来越多的研究证实，抑制活化的HSCs、诱导HSCs凋亡对有效控制肝纤维化起着至关重要的作用。
本研究中，笔者成功分离获得了HF大鼠肝脏HSCs并在体外培养；构建了OM-liposome，并将其作用于体外培养的HSCs。结果发现，HSCs胞内凋亡小体形成增加，处于DNA合成期的HSCs百分比数量明显降低，细胞活性明显下降，提示OM-liposome可诱导HSCs凋亡。
新型人工合成的RGD肽是一类含有RGD的短肽，是整合素与其配体结合的识别位点。由于细胞表面的整合素介导ECM与HSCs细胞膜受体结合，影响HSCs的生物学功能，RGD能够竞争性与整合素结合，不但减少ECM与HSCs黏附，还可作为HSCs的特异性配体[6]。本研究建立了RGD-OM-liposome并将其作用于体外培养的HSCs，结果发现，RGD可显著增加OM-liposome在HSCs中的分布。不仅如此，RGD亦可显著增强OM-liposome增加HSCs胞内凋亡小体、减少处于DNA合成期的HSCs百分比及抑制HSCs细胞活性的作用。
综上所述，本研究建立了OM-liposome和RGD-OM-liposome，通过体外实验证实RGD可促进OM-liposome在HSCs中的分布，从而增强其诱导HSCs凋亡的作用，提示OM可能通过诱导HSCs凋亡减轻肝纤维化。
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参考文献
][1] Shi GF，Li Q. Effects of oxymatrine on experimental hepatic fibrosis and its mechanism in vivo [J]. World Journal of Gastroenterology，2005，11（2）：268-271.
[2] Friedman SL. Molecular regulation of hepatic fibrosis， an integrated cellular response to tissue injury [J]. J Biol Chem，2000，275（4）：2247-2250.
[3] Liu Y，Zhang XJ，Yang CH，et al. Oxymatrine protects rat brains against permanent focal ischemia and downregulates NF-kappaB expression [J]. Brain Res，2009，1268：174-180.
[4] Ling Q，Xu X，Wei X，et al. Oxymatrine induces human pancreatic cancer PANC-1 cells apoptosis via regulating expression of Bcl-2 and
IAP families， and releasing of cytochrome c [J]. J Exp Clin Cancer Res，2011，30：66.
[5] Kim MR，Kim HS，Lee MS，et al. Cell cycle protein profile of the hepatic stellate cells （HSCs） in dimethylnitrosamine-induced rat hepatic fibrosis [J]. Experimental && molecular medicine，2005，37（4）：335-342.
[6] 杜施霖，王吉耀，陆伟跃.含有RGD序列的环肽与大鼠肝星状细胞受体体外结合特性的研究[J].中华肝脏病杂志，2005，13（5）：4