摘 要：目的：研究不同剂量放射线对大鼠涎腺Rad 50表达的影响。方法：将36只雄性Wistar大鼠，随机分成6组：分为对照组（未放射），实验组为3 Gy组、6 Gy组、9 Gy组、12 Gy组、15 Gy组。实验组用Co60一次性放射后，2 h内处死大鼠。免疫组织化学法了解Rad 50在大鼠腮腺、颌下腺表达水平和定位。结果：Rad 50在大鼠腮腺中主要表达于导管系统和浆液性腺泡，在颌下腺浆液性腺泡中也有表达，在导管和黏液性腺泡中弱表达。大鼠浆液性腺泡中15 Gy组与对照组相比表达减少，差异有统计学意义（P＜0.05），其余各放射组与对照组涎腺组织中的Rad 50表达差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：Rad 50表达水平和定位在大鼠腮腺和颌下腺中有些差异，可能参与了涎腺放射敏感性的机制。
关键词：Rad 50；放射；腮腺；颌下腺
国外研究报道，Rad 50是一种维持染色体结构稳定的相关蛋白，是组成MRN（Mre11-RAD50-Nbs1 complex）复合体3个亚单位的其中一个蛋白，在组织细胞放射性损伤DNA修复过程中有至关重要的作用[1]。目前认为，鼻咽癌放射治疗中的放射线可导致涎腺组织损伤，但不同剂量放射线对大鼠涎腺Rad 50表达的影响，以及在不同腺泡及导管的表达是否有差异性，尚未见报道。研究采用免疫组织化学法，检测Rad 50在大鼠腮腺、颌下腺表达水平和定位，研究其在涎腺损伤修复过程中的意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料：选用质量为250～300 g健康雄性Wistar大鼠36只（购自广西医科大学医学动物实验中心）。随机分为对照组、3 Gy组、6 Gy组、9 Gy组、12 Gy组、15 Gy组，每组各6只。以Co60 γ射线为放射源，头颈部为放射野，其他部位受铅块保护，10 mm厚铅块保护周围组织，皮源距为80 cm，照射中心在皮下0.5 cm，采用分割照射，模拟人体照射的方法。待大鼠麻醉后照射，麻醉时以每公斤体重水合氯醛350 mg为标准进行腹腔注射，麻醉后按组别分别照射大鼠的放射野，每个组一次达到所需剂量照射。每次放疗完成后2 h内处死大鼠，取腮腺、颌下腺组织标本待查。
1.2 仪器、试剂与实验方法：Co60放射治疗机780C（加拿大）；倒置相差显微镜CX41（Olympus，日本）； Rad 50兔抗鼠多克隆抗体购于美国sigma公司；免疫组化SABC试剂盒购于武汉博士德公司，其他试剂均为进口分装或国产分析纯。操作方法按说明书进行，于400倍镜下随机选取5个不连续视野，运用Ipp6.0的平均光密度值mean optical density=IOD SUM/area SUM对各组图片进行半定量分析，对比分析Rad 50在大鼠腮腺、颌下腺表达水平和定位。
1.3 统计学分析：采用SPSS 13.0统计软件包进行数据处理，实验数据以均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Student-Newman-Keuls检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
显微镜下显示大鼠腮腺由浆液性腺泡及导管系统构成，颌下腺由浆液性腺泡、黏液性腺泡及导管系统构成。免疫组化在放射组与对照组中，阳性染色主要在细胞胞质，为棕褐色或者棕黄色，Rad 50在大鼠腮腺中主要表达于导管系统和浆液性腺泡；在颌下腺浆液性腺泡中也有表达，在导管和黏液性腺泡中弱表达。见图1。大鼠浆液性腺泡中15 Gy组与对照组相比表达减少，差异有统计学意义（P＜0.05），其余各放射组与对照组涎腺组织中的Rad 50表达两两比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。Rad 50蛋白图像半定量分析结果见表1。
B Rad 50在大鼠额下腺中的阳性表达。（免疫组织化学染色法×400）表1 各组中腮腺颌下腺Rad 50蛋白的表达（）
注：与对照组比较，①P＜0.05
3 讨论
放疗是头颈部肿瘤的主要治疗方法之一，放射治疗剂量常规在70 Gy以内，到达高剂量时会导致唾液腺的损伤，发生严重口干症，影响了患者的生存质量[2]。本实验中之所以选择3～15 Gy的剂量，是因为大鼠有可能在逐量放射3 Gy到达15 Gy，至15 Gy时会导致大鼠涎腺组织的损伤。
Rad 50、Mre11和Nbs1组成MRN（Mre11-RAD50-Nbs1 complex）复合体，Rad 50是其中一个组成蛋白，它们共同发挥着维持染色体结构稳定的作用。Rad 50结构中含有ATP绑定盒的ATP酶（ATP-binding cassette ATPase）、锌钩（Zn hook）以及卷曲螺旋（coiled-coils）等[3]。国外研究证实[1]:Rad 50是细胞DNA双链断裂（double strain breaks，DSB）中最早发现者和信号传递者之一，在DSB修复中起骨架作用，并早期募集了ATM酶，启动了DNA双链断裂修复。
放疗后涎腺损伤的原因主要是放射线导致的DNA双链断裂[1]。本实验中，Rad 50蛋白的平均光密度值随着递增的剂量，大鼠腮腺浆液性腺泡在15 Gy时才出现明显的减少（P＜0.05），但是其余各放射组与对照组相比，差异无统计学意义（P ＞0.05），提示大鼠腮腺浆液性腺泡在一定剂量范围内损伤与自我修复相对维持一定的生理平衡，超过剂量范围后将破坏这个平衡，自我的修复能力可能受到一定程度的抑制。从半定量的数值中可以看到，腮腺和颌下腺所具有的腺泡和导管相比较，腮腺中的表达均强于颌下腺，这可能是早期的腮腺对放射线更敏感的机制或反应之一。黏液性腺泡组的平均光密度值比其他组值均低，可能解释了含有黏液性腺泡较多的颌下腺及舌下腺，相比腮腺具有一定的耐放射线的现象。
本研究结果提示：Rad 50表达水平和定位在大鼠腮腺和颌下腺中有些差异，可能参与了涎腺放射敏感性的机制，其在大鼠涎腺中普遍性有待进一步验证。在以后的研究中，将进一步探索关于涎腺放射损伤修复与放射线的剂量范围及与时间倚赖性的关系，希望有助于减少放疗中的放射损伤。
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参考文献
[1] Lammens K，Bemeleit DJ，Mockel C，et al.The Mre11:Rad 50 structure shows an ATP-dependent molecular clamp in DNA double-strand break repair[J].Cell，2011，145(1):54.
[2] 应红梅，何霞云，吴永如，等.立体适形推量放射治疗在鼻咽癌首程放疗中的应用[J].中国癌症杂志，2004，14(5):466.
[3] 王代友，周 诺.MRN复合体基因在头颈肿瘤治疗中的应用概况[J].右江医学，2008，36(6):731.