摘 要：
关键词：
牙周骨缺损是牙周病的严重后果之一，一般自身很难达到完善的修复。骨形成蛋白-2（BMP-2）作为一种高效诱导成骨因子，有望提高牙周骨缺损的治疗效果。笔者就BMP-2局部基因治疗在牙周骨缺损方面的基础与应用研究进展做一综述。
1 BMP-2的作用
骨形成蛋白除了BMP-1外，都属于转化生长因子-β超家族的成员。在BMPs中，BMP-2的诱骨作用最强，是发现的唯一能单独诱导成骨的骨形成蛋白，存在于具有成骨潜质的细胞的细胞质中，可以诱导未分化的间充质细胞向成骨细胞和成牙骨质细胞分化，促进牙周组织新骨的形成[1]。研究表明，BMP-2等因子可以影响牙周膜成纤维细胞（PDLFs）碱性磷酸酶的活性，调高与矿化相关的蛋白如骨钙素和骨桥蛋白等的基因表达，促进PDLFs向成骨细胞表型的分化[2]。因此，直接应用BMP-2作用于牙周组织细胞，可以起到促进牙周间充质细胞的增殖和分化，达到治疗牙周骨缺损的作用。但是目前的研究显示，这一作用达到并可维持最佳效应的时间较短，临床应用可能需要大剂量和长期的作用，且直接应用外源性的BMP-2可能引起免疫反应等不良反应[3]。通过转基因的方法，将BMP-2基因导入靶细胞内并稳定在局部发挥生物效应，有望解决外源性细胞因子的应用不足之处。通过对牙周细胞的转染，内源性BMP-2的分泌，一方面可以促进间充质细胞的分化和增殖，另一方面亦可直接促进骨组织的生长。司晓辉等的研究表明，转染BMP-2基因后，人牙周膜成纤维细胞内可以产生BMP-2并可以在裸鼠体内诱导新骨的形成[4]。
2 靶细胞的选择
局部基因治疗的靶细胞是研究的关键问题。对于基因治疗的研究来说，靶细胞需要满足方便获取，易于培养，生长周期长等条件。可以供选择的细胞类型主要有牙周膜细胞（PDLCs），牙龈成纤维细胞（GFCs）等。牙周膜细胞是牙周骨缺损治疗的关键细胞，包括牙周膜成纤维细胞，成骨细胞，成牙骨质细胞及未分化的间充质细胞等。牙周膜成纤维细胞（PDLFs）是占比例最多的细胞，是牙周膜中最常见的细胞。PDLFs是一种具有多分化类型潜质的异质性细胞，可以产生胶原和向成骨细胞分化，产生新的牙周软硬组织。
有关研究已经证实在一定条件下，PDLFs能够向成骨细胞表型分化，表现为ALP活性增加，骨钙素、骨桥蛋白、骨涎蛋白等相关蛋白基因的高表达[5-7]。因此，选择PDLFs作为治疗牙周骨缺损的种子细胞，通过转基因技术增强目的蛋白的产生，可以在局部组织发挥作用，加强成骨机制的活性，提高修复硬组织的效率。但是，牙周膜细胞取材、组织培养较困难，体外应用的难度较大，但一些来源较为丰富的细胞也被证实了具有牙周组织修复的能力。如唐昊喆等利用hBMP2质粒载体转染GFCs，结果表明可促进GFCs向成骨细胞表型分化[8]。亦有研究认为，GFCs具备牙周膜细胞的一些特性，且取材培养易于成活，增殖迅速，原代培养的成功率和细胞增殖活性均高于牙周膜细胞。虽然GFCs中BMP-2的表达弱于牙周膜细胞，但是综合考虑仍是一种较合适的牙周组织修复研究的种子细胞[9]。其他类型的细胞研究也取得了一定的进展，如骨髓基质干细胞、牙周膜干细胞、成牙骨质细胞、牙囊细胞等，均提示靶细胞的选择是多样的。
3 载体的选择
用于局部基因治疗的BMP-2基因片段（DNA片段）很难直接通过细胞膜进入靶细胞内部。为了使基因治疗的目的基因顺利进入受体细胞，能够发挥相关的生物学效应，必须选择合适的载体。基因治疗的载体一般分为两大类：病毒载体和非病毒载体，病毒载体转染率较高，可以转染较多种类的受体细胞，可以高效率的产生目的基因。Anusaksathien O等利用腺病毒载体将血小板源性生长因子基因转染人牙龈成纤维细胞中，再将转染后的细胞植入体内，发现可以促进牙周组织的修复[10]。但是每种病毒载体都有其缺陷，从而影响了病毒载体在治疗中的应用。非病毒载体与病毒载体相比，安全性较好，材料来源广泛，不整合至宿主基因组。在表达质粒或反义表达质粒真核细胞的靶向转移中，有病毒载体不可替代的作用。但是非病毒载体的转染成功率较低，且多为瞬时表达，单独应用受到一定的限制[11]。BMP-2局部基因治疗的载体可以和一些物理手段如电穿孔技术、超声微泡转基因技术等相结合，来提高转染的成功率。有研究表明，超声微泡破裂作用可以在周围的胞膜上产生一些可逆性或者不可逆性的小孔结构，目的基因容易进入细胞内，增强目的基因的转染和表达[12]。
BMP-2局部基因治疗的途径主要有体内途径和体外途径，前者方法研究应用较多，相对成熟，但是靶细胞培养和基因转染操作步骤较复杂，技术要求较高，各种设备耗材等成本问题不容忽视，不利于临床实际操作；后者操作相对简单，方便推广，但是转染率相对较低。目前的研究多结合组织工程技术的应用等，将质粒载体和组织工程材料相复合，植入骨缺损处，形成一个缓释系统，使质粒能够稳定的转染宿主细胞，表达相关蛋白，从而起到骨缺损的修复[13]。
通过超声等物理方法有望提高体内途径的治疗效果。仲琳等的研究表明，pEGFP- N1-BMP2质粒通过超声微泡转基因的作用，可以提高牙周膜成纤维细胞中BMP-2的表达[14]。超声的作用一方面可以使基因载体顺利进入靶细胞内，增强转染率，提高表达效率，另一方面在BMP-2局部基因治疗过程中，超声作用具有良好的靶向性。如张国全等的研究表明，超声微泡介导pEGFP-C1质粒对小鼠胫前肌体内转染后，发现阳性细胞位于不同的切面，且连续出现于20～30个切面的相同位置[15]。说明超声的作用具有良好的靶向性。因此，可以设想将直接体内途径和超声等物理手段结合，在牙周骨缺损局部注入携带BMP2基因的质粒或者其他载体，同时通过优化条件下的超声作用，可增强靶向性、提高转染率，有望促进牙周骨缺损的修复效果。
5 小结
综上所述，BMP-2局部基因治疗牙周骨缺损有着良好的应用前景。基因技术发展到今天，为牙周治疗提供了更为广阔的视野。BMP-2局部基因治疗牙周骨缺损，通过BMP-2转染局部靶细胞产生具有治疗作用的细胞因子，促使牙周组织细胞中具有成骨潜质的细胞分化，产生连锁效应，能够很好的促进牙周骨组织的生长和修复。目前的多种物理手段尤其是超声技术的的应用，可以提高局部基因转染率，增强治疗效果。但是目前的研究很多还处于基础阶段，研究的方向也较为分散，形成一个完善的治疗序列尚需时日。
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