作者：赵蕾，赵兴春，张庆霞，叶健，刘雅诚
【关键词】 福尔马林固定;石蜡包埋组织;MiniSTR
在法医实践中，会遇到对福尔马林固定石蜡包埋组织进行个体识别的案件。通常，从福尔马林固定石蜡包埋组织内提取DNA要经过一系列繁琐的程序，很容易导致DNA的丢失，并且此类检材极易发生降解，使得检验难度增加。
1 案例
2例福尔马林石蜡包埋组织，分别为肝脏组织和绒毛组织。石蜡包埋的组织块距检验最长两年。要求进行DNA检验并与相应送检血样进行比对。
2 检测方法与结果
2.1 脱蜡与水化切片 切取上述石蜡包埋组织切片10.0μm厚10片，用手术刀片剔除组织周围多余石蜡，放入1.5ml的Eppendorf离心管中，加入1ml的二甲苯常温脱蜡，2h后吸弃管中液体，再次加入1ml二甲苯，常温脱蜡12h。分别以无水乙醇脱水2次，95%乙醇，75%乙醇，50%乙醇，25%乙醇脱水各1次，每一步骤间隔2h，每次加入1ml。最后用灭菌去离子水1ml清洗组织片1次。
2.2 消化组织片 加入PercollTM(Amersham Biosciences公司)分离液400μl，20mg/ml蛋白酶K 30μl，10% SDS 40μl，置37℃消化24h。其间追加20mg/ml蛋白酶K 60μl。
2.3 DNA提取及纯化 采用有机法提取DNA，将提取的DNA溶液全部置于MicroconTM100纯化柱(Millipore公司)，2500rpm离心20min，再将纯化柱倒置一干净的1.5ml的Eppendorf管中，3500rpm离心10min，收集管内液体用于扩增。
2.4 扩增分离 扩增分别使用AB公司IdentiFilerTM试剂盒和MiniFilerTM试剂盒，反应体积均为25μl，模板量为2μl。扩增和检测分析使用9700型PCR扩增仪和3130XL型基因分析仪(AB公司)。
2.5 结果 石蜡包埋组织用IdentiFilerTM试剂盒扩增荧光信号弱，平均荧光信号强度约<100rfu，其中检材1在D7S820，CSF1PO，D16S539，D2S1338，D18S51，FGA基因座没有得到基因分型;检材2则仅在D5S818得到基因分型;用MiniFilerTM试剂盒扩增，平均荧光信号强度>400rfu，并且使用IdentiFilerTM试剂盒扩增时丢失的大片段等位基因能够成功得到DNA分型。但是在检材2中的D21S11基因座仍未能得到分型。MiniFilerTM试剂盒检测的DNA分型结果可以作为IdentiFilerTM试剂盒的补充(见表1)，与送检比对人员的血样DNA分型结果完全一致。表1 石蜡样本DNA分型结果比对
3 讨论
石蜡包埋组织的DNA提取，文献对脱蜡和水化切片的方法报道各不相同。本案例认为在石蜡包埋组织初始脱蜡过程中，用二甲苯脱蜡和不同浓度的乙醇水化切片非常关键[1]。若脱蜡不够充分，残余的石蜡会影响PCR的反应。使用不同浓度的乙醇可以充分去除二甲苯并且可以使水分进入细胞，利于消化过程的进行。在消化过程中加大了蛋白酶K的用量，并且每隔12h左右追加蛋白酶K 1次，达到完全消化组织的目的，要求肉眼看不到组织块。
2例检材在使用IdentiFilerTM试剂盒扩增时，扩增片段长度>250bp的基因座均没有得到分型结果。这是因为福尔马林固定石蜡包埋组织中DNA常常发生交联并降解为较小片段[2]。而使用MiniFilerTM试剂盒扩增时，由于在普通STR基础上使引物结合区更加靠近核心序列，其所包含的与IdentiFilerTM试剂盒中相同基因座的扩增片段范围缩短到74～245bp之间，从而可提高对此类降解检材DNA分型的成功率[3]。但在本报告中，1例福尔马林固定石蜡包埋组织在D21S11基因座没有得到分型，说明此例检材已降解小于该基因座的扩增片段。
在日常检案中，福尔马林固定石蜡包埋检材在常用的STR复合扩增试剂盒得不到完整的分型结果时，可以使用MiniFilerTM试剂盒进行检验，从而尽可能得到此类检材完整的STR分型结果。
参考文献
1 盖宝东，房学东，金仲田.提高石蜡包埋组织中提取DNA质量的实验研究.吉林大学学报(医学版)，2003，29(1)：115- 118.
2 田子强，刘俊峰，张少为，等.普通甲醛固定石蜡包埋组织提取方法的探讨.癌症，2004，23(3):342-345.
3 周怀谷，张晨.全基因组扩增法用于低拷贝数DNA检测.法医学杂志，2006，22(1)：43-47.