小鼠窦前卵泡的玻璃化冷冻方法研究

　　　　　　 作者：常娟娟， 江一平， 王明权

【摘要】 目的 对性成熟前小鼠的窦前卵泡采用不同的方法进行玻璃化冷冻，探讨不同冷冻方法对卵泡复苏率的影响。 方法 用Ⅰ型胶原酶和脱氧核糖核酸酶Ⅰ分离10～14 d ICR雌鼠的卵巢，共进行A、B两个实验，每次实验对获得的卵泡分为4组，1组作为新鲜对照组，其余3组采用不同的冷冻方法处理，试验A采用常规玻璃化法、－205 ℃玻璃化法和液氮网篮法；试验B采用－205 ℃玻璃化法、液氮网篮法和－205 ℃表面玻璃化法，卵泡复苏后进行台盼蓝染色，计算各组卵泡复苏率。 结果 液氮网篮和－205 ℃玻璃化冷冻的冷冻效果一致，两种方法的卵泡复苏率差别无统计学意义；常规玻璃化的冷冻效果最差，－205 ℃表面玻璃化冷冻的冷冻效果最好，其冷冻小鼠窦前卵泡的复苏率达(83.02±4.10)%。 结论 －205 ℃表面玻璃化是一种较好的冷冻窦前卵泡的方法。

【关键词】 卵泡；卵子；冷冻；组织保存；小鼠，近交ICR

　　ABSTRACT: Objective To investigate the influence of different methods on the recovery rate of preantral follicle of immature mice after they were treated with vitrification and freezethawing. Methods Collagenase I and DNase I were used to separate the ovarian tissue of the ICR female mice(10～14 d of age).Two experiments (A and B) were carried out，in each of which the follicles obtained after cleaning were pided into four groups，one as a control group，the other three groups given vitrifiable cryoprotection with different methods.In Experiment A，conventional vitrification，－205 ℃ vitrification and metal net were used，while in Experiment B， －205 ℃ vitrification，metal net and －205 ℃ surface vitrification adopted.After recovery， follicles were stained with trypan blue， and the recovery rates were calculated. Results In the two experiments，the effect of metal net and －205 ℃ vitrification are consistent.There were not significant differences between them.The effect of conventional vitrification was the worst.In addition，the effect of －205 ℃ surface vitrification was the best，with a recovery rate of (83.02±4.10)%. Conclusion －205 ℃ surface vitrification is a desirable way to freeze preantral follicles.

　　KEY WORDS: ovarian follicle;ovum;freezing;tissue preservation;mice，inbred ICR

　　卵巢组织、细胞的冷冻保存技术是生殖工程的重要内容之一，可为体外授精、显微授精和体细胞核移植等需要储备和供应卵源的实验提供技术保障[1]。在既往的研究中，冷冻复苏的卵母细胞和卵巢组织都有部分能够发育到囊胚或者生育幼仔[26]，说明冷冻复苏后的卵母细胞及或各级卵泡保持了正常的发育潜能。但采用常规程序冷冻法和常规玻璃化冷冻法保存的卵巢组织、细胞，复苏率不高且方法繁琐[4]。本研究采用从小鼠卵巢分离的窦前卵泡为材料，探索建立适宜的窦前卵泡快速玻璃化冷冻保存技术，为卵泡保存和生殖工程提供技术基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物来源

　　出生10～14 d的 ICR雌鼠[上海斯莱克实验动物有限责任公司，SCXK（沪）2003003]。

　　1.2 仪器及试剂

　　Vitmaster玻璃化快速冷冻仪（URVD 000036，英国IMT Ltd）；ɑMEM(32571，美国Gibco公司)；牛血清白蛋白（BSA，A3311，美国Sigma公司）；Ⅰ型胶原酶（collagenaseⅠ，265，美国Gibco公司）；1 mg/mL脱氧核糖核酸酶（DNaseⅠ，10104159001，瑞士Roche公司）；HEPES（H6147，美国Sigma公司）；乙二醇（EG，E9129，美国Sigma公司）；海藻糖[D（＋）Trehalose dihydrate，T0167，美国Sigma公司]；聚乙烯吡咯烷酮（PVP，0507，美国Amresco公司）；台盼蓝干粉（Trypan，T6146，美国Sigma公司）；含卵泡分离液的双腔培养皿（353037，美国Falcon公司）；清洗皿：含体外操作液的35 mm培养平皿（353001，美国Falcon公司）。

　　1.3 方法

　　1.3.1 溶液配制

　　基础液：采用添加4 mg/mL牛血清白蛋白的αMEM作为卵泡分离液、体外操作液、玻璃化冷冻液和复苏液的基础液；卵泡分离液：于基础液中添加3 mg/mL Ⅰ型胶原酶、1 mg/mL脱氧核糖核酸酶Ⅰ；体外操作液：于基础液中添加25 mmol/L HEPES；平衡液（equilibration medium，EM）[7]：于基础液中添加4%乙二醇；玻璃化冷冻液（solid surface vitrification，SSV）[7]：于基础液中添加35%乙二醇0.4 mol/L海藻糖、5%聚乙烯吡咯烷酮；复苏液：包括Ⅰ、Ⅱ，分别为基础液中添加0.3 mol/L、0.15 mol/L海藻糖；台盼蓝染液（0.4%）：0.4 g台盼蓝干粉溶于100 mL生理盐水。

　　1.3.2 分离窦前卵泡

　　颈椎脱臼法处死小鼠，消毒腹部皮肤，打开腹腔，找到卵巢，取出双侧卵巢，放入PBS中清洗，转移2～4个卵巢至0.5 mL的卵泡分离液中，在体式显微镜下用尖镊撕碎并用滴管吹打后，放入37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中3 min。每隔3 min取出培养皿，滴管吹吸，每次吹吸后都要观察是否有卵泡掉出，如有掉出，随即转移至清洗皿的基础液中清洗2遍，操作时动作尽量精细，以维持卵泡基底膜完整。

　　1.3.3 分组

　　共进行A、B两个实验，每次实验对获得的卵泡分为4组，1组作为新鲜对照组，其余3组采用不同的冷冻方法处理。

　　1.3.3.1 实验A

　　采用常规玻璃化法、－205 ℃玻璃化法和液氮网篮法分别进行冷冻保存操作。分为A1：新鲜卵泡对照组，将直接对卵泡进行台盼蓝染色，计数死、活细胞数，以计算卵泡的存活率；A2：常规玻璃化组，卵泡转移至50 μL的EM中4 min；再转移卵泡至SSV中，连续转移3次（卵泡与SSV接触时间25～30 s）；转移含卵泡的SSV 100 μL至冷冻管中，随即直接投入液氮罐保存；A3：－205 ℃玻璃化组，卵泡转移至50 μL的EM中4 min；再转移卵泡至SSV中，连续转移3次；转移含卵泡的SSV 100 μL至冷冻管中，将冷冻管投入Vitmaster玻璃化快速冷冻仪（-205 ℃）装置中，继而转入液氮罐中保存；A4：液氮网篮组，卵泡转移至50 μL的EM中4 min；再转移卵泡至SSV中，连续转移3次；将卵泡小液滴（共100 μL）滴到和液氮直接接触的网篮上（-196 ℃），小液滴立即形成透明的小冰珠；转移小冰珠至预冷的冷冻管中，密封后投入液氮罐保存。福建医科大学学报 2009年9月 第43卷第5期常娟娟等：小鼠窦前卵泡的玻璃化冷冻方法研究

　　1.3.3.2 实验B

　　采用-205 ℃玻璃化法、液氮网篮法和－205 ℃表面玻璃化法分别进行冷冻保存操作。分为B1：新鲜卵泡对照组，操作方法同A1；B2：-205 ℃玻璃化组，操作方法同A3；B3：液氮网篮组，操作方法同A4；B4：－205 ℃表面玻璃化组，卵泡转移至50 μL的EM中4 min；再转移卵泡至SSV中，连续转移3次；转移含卵泡的SSV 100μL至事先放置于快速冷冻仪（-205 ℃）装置中预冷的的冷冻管中（表面温度-205 ℃）；冷冻管密封后投入液氮罐保存。

　　1.3.4 卵泡复苏方法

　　两个实验的复苏方法相同。从液氮罐中取出冻存管，立即放入37 ℃水浴锅，摇晃至冰珠完全融解（<2 min）；转移融解的冻存液至1滴500 μL的复苏液Ⅰ（0.3 mol/L Trehalose）中3 min；再转移至复苏液Ⅱ（0.15 mol/L Trehalose）中3 min；转移卵泡至M2中，清洗1～2遍后台盼蓝染色。

　　1.3.5 台盼蓝染色

　　新鲜卵泡或冷冻复苏后的卵泡与0.4%的台盼蓝染液等体积混合，5～10 min内观察卵泡的染色情况，并分别计数被染成蓝色（死卵泡）、未染成蓝色（活卵泡）的卵泡数；分别按下式计算存活率和复苏率：

　　存活率=[活卵泡数/（死卵泡数+活卵泡数）]×100%

　　复苏率=（冷冻复苏后卵泡存活率/新鲜卵泡存活率）×100%

　　1.4 统计学处理

　　采用SPSS 11.5软件处理数据。 单因素方法分析（one way ANOVA）比较组内复苏率，各组均数以最小显著差法（least significant difference，LSD）、SNK、Duncan进行两两比较和显著性检验。

　　2 结 果

　　2.1 形态学观察

　　倒置显微镜下可见，分离出的窦前卵泡大部分呈圆形或卵圆型，有完整的颗粒细胞层，色泽明亮，层次分明，颗粒细胞层周围光滑；颗粒细胞层数较少的卵泡及卵母细胞清晰可见，位于卵泡的中间或略偏一侧，镜下表现为圆而明亮，胞质均匀；颗粒细胞层数较多的卵泡在镜下看不清卵母细胞，其颗粒细胞密而紧凑，紧紧包围着卵母细胞，其外围与膜紧密相连，外观光洁明亮均质。少量卵泡表现为基底膜模糊或破损，卵泡细胞松散或游离到卵泡外，卵母细胞逸出卵泡，变形或崩解。冷冻前后卵泡在形态上无明显差别。

　　2.2 台盼蓝染色结果

　　活卵泡未被染色，死卵泡被染成蓝色（图1）。

　　2.3 不同方法复苏率比较

　　不同方法冷冻复苏小鼠窦前卵泡的复苏率见表1。A，B实验中，液氮网篮和－205 ℃玻璃化冷冻的冷冻效果一致，两种方法的卵泡复苏率差别无统计学意义；常规玻璃化的冷冻效果最差，－205 ℃表面玻璃化冷冻的冷冻效果最好。表1 不同冷冻方法对小鼠卵泡复苏率的比较（略）

　　3 讨 论

　　在辅助生殖医疗实践中，以往常用程序化慢速冷冻法来冻存胚胎或生殖细胞。但该法需昂贵的高精密程序降温仪、操作复杂繁琐（全程约需2.5～3 h）、耗液氮量多，并且无法完全避免冰晶形成，使冷冻效率难于提高，尤其不利于进行卵泡和卵巢碎片等较大体积的组织冷冻。近年发展起来的玻璃化冷冻技术具有简便、快速、经济等优点，尤其是可以避免细胞内外形成冰晶，不仅提高了冷冻效率，也大大提高了较大体积组织冷冻的可行性，因此成为生殖工程领域的一个研究热点[8]。玻璃化冷冻技术是采用适当高浓度的冷冻保护剂，结合某些高分子物质配制成玻璃化冷冻保护液来预处理细胞，并以快速的制冷速度，使细胞内外液体形成玻璃化状态以避免冰晶的形成。

　　玻璃化冷冻操作的关键是保证极快的降温速率。采用开放性操作，将悬液滴于金属环、网并直接投入液氮是公认降温速率最快的方法[911]，但因悬液直接接触液氮可能造成污染而不实用。因此，目前普遍采用的玻璃化冷冻操作方法，是将混悬有细胞/组织的玻璃化冷冻保护液（以下简称“悬液”）加入塑料冷冻管中，而后将冷冻管迅速直接投入液氮。这种做法会导致冷冻管在投入液氮的瞬间使液氮沸腾，造成管壁周围产生大量气泡而形成一层不易导热的屏障，从而使降温速率受到削弱，最终使玻璃化冷冻技术的效率难于理想地发挥。为了克服这个缺点，Dinnyes等建立了固体表面玻璃化的冷冻方法，将悬液滴在预先浸裕于液氮中的金属杯的内表面，使悬液直接接触到－150℃～－180℃的固体表面，有效地提高了冻存效果[7]；Huang等采用了一种新的装置，通过抽真空使液氮温度进一步降低至－205 ℃，从而使加快了冷冻管及其悬液的降温速率，也达到了更好的玻璃化冷冻效果[12]。本研究将上述两种方法相结合，建立了－205 ℃表面玻璃化操作方法，用于冷冻保存小鼠窦前卵泡，并通过比较实验来考察其冷冻保护效果。

　　本研究参照文献[7]的玻璃化冷冻保护液，比较了常规玻璃化法、液氮网篮法、－205 ℃玻璃化法、－205 ℃表面玻璃化法等4种不同冷冻操作方法的冷冻保护效果。其中，液氮网篮法是开放性操作方法，采用在液氮的液面安置一个不锈钢网篮，将悬液滴在网篮表面，使悬液直接接触液氮（理论温度－196 ℃）。实验结果表明，液氮网篮法和－205 ℃玻璃化法的冷冻卵泡复苏率均高于常规玻璃化法，而－205 ℃表面玻璃化的复苏率又优于前两者，是4组比较实验中最佳的操作方法。液氮网篮法相当于将组织直接和液氮接触，而－205 ℃玻璃化组的冷冻温度较低，故两者都加快了热交换速率，提高了冷冻速率。－205 ℃冷冻是一种特殊的超速冷却的玻璃化，超冷却液氮的冷却速率可以达到100 000 ℃/min，远高于常规玻璃化的冷却速率（2 500 ℃/min），因此冷冻保护效果优于常规玻璃化法。但－205 ℃玻璃化法的冷冻保护并不优于液氮网篮法，其原因可能就在于冷冻管的使用削弱了超冷却液氮的降温速率。在－205 ℃表面玻璃化法，笔者将冷冻管预先浸裕到液氮中，而后抽真空使系统达到－205 ℃。这样就使卵泡组织悬液滴入冷冻管时直接接触到近于－205 ℃的超冷表面，既避免了冷冻管投入－205 ℃液氮后产生的氮气层，又排除了液氮温度通过冷冻管壁传导过程造成降温速率降低，使冷冻仪的降温速率得到最佳的发挥。在此超低温环境下悬液发生玻璃化，细胞内外均无冰晶形成，明显减少了冷冻损伤。同时，由于降温速率的提高使悬液迅速玻璃化，也缩短了卵泡在较高温区与冷冻保护液的接触时间，减少了冷冻保护液对细胞的毒性影响。

　　本研究采用－205 ℃表面玻璃化操作方法进行了15例的重复实验，卵泡的冷冻复苏率达到了(83.02±4.10)%，变异系数只有4.93%，说明实验结果高度稳定。此外，本方法直接在冷冻管中进行玻璃化冷冻，冷冻后直接置于液氮中长期保存，不必象一般固体表面玻璃化那样进行冷冻体转移[7]，也避免了液氮网篮法那样使悬液直接接触液氮而遭受污染。

参考文献

　　[1] Hasegawa A，Hamada Y，Mehandjiev T. In vitro growth and maturation as well as fertilization of mouse preantral oocytes from vitrified ovaries[J]. Fertil Steril， 2004，81(1):824830.

　　[2] Wu J，Zhang L，Wang X. In vitro maturation， fertilization and embryo development after ultrarapid freezing of immature human oocytes[J]. Reproduction， 2001，121(3):389393.

　　[3] Segino M，Ikeda M，Hirahara F. In vitro follicular development of cryopreserved mouse ovarian tissue[J]. Reproduction， 2005，130(2):187192.

　　[4] Dela Pens E C，Takahashi Y，Katagiri S. Birth of pups after transfer of mouse embryos derived from vitrified preantral follicles[J]. Reproduction， 2002，123(4):593600.

　　[5] Migishima F，SuzukiMigishima R，Song S Y， et al. Successful cryopreservation of mouse ovaries by vitrification[J]. Biol Reprod， 2003，68(3):881887.

　　[6] Claus Y A， Mikkel R， Anne G B. Two successful pregnancies following autotransplantation of frozen/thawed ovarian tissue[J]. Hum Reprod， 2008，10（23）：22662272.

　　[7] Dinnyes A，Dai Y，Jiang S. High developmental rates of vitrified bovine oocytes following parthenogenetic activation，in vitro fertilization，and somatic cell nuclear transfer[J]. Biol Reprod， 2000，63(2):513518.

　　[8] Vajta G. Vitrification of the oocytes and embryos of domestic animals[J]. Anim Reprod Sci， 2000，6061:357364.

　　[9] Kim S H，Ku S Y，Sung K C. Simplified EM grid vitrification is a convenient and efficient method for mouse mature oocyte cryopreservation[J]. Yonsei Med J， 2006，47(3):399404.

　　[10] 孙正怡，何方方，郁 琦. 冷冻环玻璃化法与程序冷冻法对人囊胚冷冻复苏效果的比较[J]. 生殖医学杂志， 2006，15(3):161164.

　　[11] 王雁林，朱桂金，魏玉兰. Cryoloop和CPS超速玻璃化冷冻人三原核胚胎效果比较[J]. 中国妇幼保健， 2006，21(11):15341536.

　　[12] Huang C C，Lee T H，Chen S U. Successful pregnancy following blastocyst cryopreservation using supercooling ultrarapid vitrification[J]. Hum Reprod， 2005，20(1):122128.