含氮大环内酯类免疫抑制剂产生菌的系统进化分析

　　　　　　 作者：连云阳，陈路劼；程元荣

【摘要】 目的 探讨含氮大环内酯免疫抑制剂FK506等不同产生菌之间进化关系及其次级代谢产物合成基因的水平转移。 方法 克隆不同产生菌的16S rRNA基因以及FK506等代谢产物羟化酶、甲基转移酶基因，采用Mega程序应用不同模型构建菌株系统进化树和合成酶分子进化树。 结果 代谢产物结构差异越大，其合成酶基因的进化关系越远，但是其产生菌的进化关系却可能较为接近，产生菌的进化关系与代谢产物合成酶分子进化关系不同步。 结论 此类次级代谢产物合成基因并不是菌株本身固有的，而是在菌株进化过程中同属不同种微生物之间发生基因水平转移获得的。

【关键词】 西罗莫司； 序列分析； 克隆，分子； 免疫抑制剂； 基因转移，水平

Phylogenetic Analysis of NitrogenContaining Macrolide
Immunosuppressant Producing Streptomyces Strains

　　LIAN Yunyang， CHEN Lujie， CHENG Yuanrong

　　1. Fujian Provincial Key Laboratory of Screening for Novel Microbial Products， Fujian Institute of Microbiology， Fuzhou 350007， China;

　　2.pison of Pharmacy， Fujian Medical University， Fuzhou 350004， China

　　ABSTRACT: Objective To reveal the evolution relationship of the producers of immunosuppressant FK506， ascomycin and sirolimus and the horizontal gene transfer of their biosynthetic genes. Methods Almost full sequences of the 16S rRNA genes and both cytochrome P450 hydroxylase and methyltransferase genes involved in the biosynthesis of FK506， ascomycin or sirolimus were cloned from different producers， respectively. Phylogenetic neighbourjoining trees， based on 16S rRNA genes， cytochrome P450 hydroxylase or methyltransferase sequences were constructed by Mega 4 programe using different models， respectively. Results Phylogenetic trees showed that the evolution relationship of the two proteins differed from that of the tested five strains. Conclusions The results of inconsistencies between the molecular evolution of biosynthetic enzyme and taxonomic relationships of the producing strains are best explained by horizontal gene transfer，namely， antibiotic biosynthesis genes transfer laterally between Streptomycetes during evolution.
　　
　　KEY WORDS: sirolimus; sequence analysis; cloning，molecular;immunosuppressive agents; gene transfer，horizontal

　　福建医科大学学报 2009年9月 第43卷第5期连云阳等：含氮大环内酯类免疫抑制剂产生菌的系统进化分析化学结构相似的FK506、Sirolimus和Ascomycin（FK520）等含氮大环内酯类免疫抑制剂具有重要的实用价值，不仅在临床上应用于器官移植抗排斥作用，有的已成功用于药物洗脱支架、抑制血管扩张术后的再狭窄，有的还具有很好的抗肿瘤作用，应用前景广阔[12]。这三种大环内酯类免疫抑制剂分别由不同种的链霉菌发酵产生[34]，同属不同种的链霉菌产生化学结构相似的化合物，它们在系统进化上有何关系引起大家的兴趣。笔者通过克隆分析FK506、Sirolimus和Ascomycin不同产生菌的16S rDNA及两个合成酶基因（羟化酶和甲基转移酶基因），分析菌种的进化关系和次级代谢产物合成酶分子进化关系，探讨抗生素合成基因在微生物之间的水平转移，在分子水平上了解这些重要工业菌株的遗传背景，可能从合成机制和基因水平上对今后高单位菌种的选育工作和筛选结构修饰的新衍生物有重要的参考价值。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 菌株

　　FK506产生菌Streptomyces sp. FIM 260990、Streptomyces sp. FCZ0311及其突变株FCZ031120；Sirolimus产生菌S. hygroscopicus FC904均为本所保藏菌株。Ascomycin 产生菌Streptomyces sp. FIM 260840由郑卫研究员提供。克隆宿主菌E.coli DH10B由西班牙奥维也多大学Jose A.Salas教授赠送。

　　1.1.2 主要试剂

　　连接酶、限制性内切酶为Fermentas产品；PCR试剂盒、克隆载体pUCmT、Xgal、IPTG购自上海申能博彩公司；质粒提取试剂盒购自北京博大泰克公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 目的基因扩增

　　1.2.1.1 DNA提取

　　目的菌株孢子悬液接种于TSB（Tryptic Soy Broth， BD）培养基中，28 ℃ 220 r/min振荡培养36～48 h，收集菌丝体，采用溶菌酶法提取全DNA[5]。

　　1.2.1.2 16S rDNA扩增 采用引物

　　27f ：5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’
　　1492r ：5’TACGGCTACCTTGTTACGACTT3’
PCR扩增：94 ℃ 20 s→56 ℃ 30 s→72 ℃ 3 min，30个循环[6]。

　　1.2.1.3 代谢产物合成酶基因克隆

　　Sirolimus合成酶cytochrome P450 C9hydroxylase/ 39Omethyltransferase基因参照文献[7]报道的相关基因序列设计引物

　　rapf:5’TGACCTGGAAGGACCACC3’
　　rapr:5’AATAGCCGCAGAAGCCAC3’
FK506合成酶cytochrome P450 C9hydroxylase/31Omethyltransferase基因扩增，参照文献[8]报道相关序列设计引物扩增Streptomyces sp. FIM 260990合成基因。

　　Taf:5’GACAAGCTCTCCCGTACCTG3’
　　Tar: 5’GCACCTCACCAACGTATTCC3’
产生菌FCZ0311及FCZ031120采用引物扩增合成基因。

　　506DMf:5’GGAAGGACCACCGATGAG3’
　　506DMr: 5’AACAGCACCTCACCAACG3’
Ascomycin产生菌Streptomyces sp. FIM 260840合成酶P450 C9hydroxylase/ 31Omethyltransferase基因[9]扩增引物
　　Asf:5’GCCCATACCTGGAAGGACTA3’
　　Asr: 5’CAACTGCCCAAGGAACTGTC3’
扩增产物分别经琼脂糖凝胶纯化，克隆到pUCmT载体，酶切分析后测序。每个克隆序列均分别采用Taq酶和高保真聚合酶Pfu进行扩增测序，保证序列的正确性。

　　1.2.2 菌株16S rDNA序列及合成酶分子进化树构建

　　把获得的各菌种16S rDNA序列与GenBank数据库进行比对，并从LPSN典型菌株数据库中获得相关菌株的16S rDNA序列，用Clustal X1.8软件进行序列对排， Mega 4软件采用Neighbourjoining方法（Kimura 2parameter模型）构建进化树，进化树稳定性用BOOTSTRAP分析，重复次数为1 000。合成酶分子采用Poisson correction模型构建分子进化树。

　　2 结 果

　　2.1 五株产生菌进化关系分析

　　扩增的16S rDNA序列经过Blast比对，Sirolimus产生菌S. hygroscopicus FC904的16S rDNA序列与另一株Sirolimus产生菌S. hygroscopicus NRRL B5491同源性最高，有3个碱基的差异（1 446/1 449 bp），与Ascomycin产生菌Streptomyces sp. FIM 260840同源性也很高，有9个碱基的差异（1 439/1 448 bp），两者具有较近的进化关系（图1），在进化树上两者处于同一个簇；FK506产生菌Streptomyces sp. FCZ0311与FCZ031120的16S rDNA序列完全一致，这一结果与高产菌株FCZ031120是从亲本Streptomyces sp. FCZ0311人工诱变而来是一致的。FK506产生菌Streptomyces sp. FIM 260990的16S rDNA序列与另一株FK506产生菌Streptomycessp. ATCC 55098具有很高同源性，16S rDNA序列有两个碱基的差异，但与Streptomyces sp. FCZ0311同源性较低，约96% (1 378/1 435 bp)，虽然两者都能产生免疫抑制剂FK506，但分别处于两个进化分支，而且两株FK506产生菌与Sirolimus和Ascomycin产生菌的进化关系也较远。

　　2.2 两个次级代谢产物合成酶基因克隆和进化分析

　　Cytochrome P450 C9hydroxylase/31Omethyltransferase是FK506和Ascomycin的两个合成酶，催化内酯环侧链修饰，对应的Sirolimus也有相似的两个合成酶Cytochrome P450 C9hydroxylase/39Omethyltransferase。从已报道的相关合成基因簇可以知道这两个合成酶基因部分重叠，形成共转录子[10]。由于此类化合物合成基因簇分子较大，均在100 kb左右，笔者选择了这两个合成酶基因进行代谢产物合成酶分子的进化关系分析，探讨不同菌株合成基因的进化关系。

　　2.2.1 Sirolimus产生菌合成酶基因

　　以Sirolimus产生菌FC904染色体为模版，以rapf和rapr为引物PCR扩增产物长2 023 bp，含2个ORF（分别命名为rapJ和rapI基因），纯化后克隆到载体pUCmT，质粒命名为pFJ1501（图2）。克隆的rapJ基因与报道的Sirolimus另一株产生菌S. hygroscopicus NRRL 5491的P450 C9hydroxylase的氨基酸同源性达98.2%。克隆的rapI基因与报道的S. hygroscopicus NRRL 5491的39Omethyltransferase基因氨基酸同源性97.7%[7]，均含261个氨基酸，6个氨基酸发生变换。主要变异发生在肽链的N端，其中第12位起氨基酸序列由NGKTV变为YGRPS，另外第94和第204位氨基酸分别发生丙氨酸与甘氨酸互换。

　　2.2.2 FK506产生菌合成酶基因

　　2.2.2.1 菌株FIM 260990合成酶基因

　　以FK506产生菌FIM 260990染色体为模版， PCR扩增的片段同样含有2个ORF。其编码氨基酸序列与GenBank上收录的ATCC 55098菌株的对应P450 C9hydroxylase和31Omethyltransferase序列100％一致，与16S rDNA序列的比对结果一样，FIM 260990菌株与FK506产生菌Streptomyces sp. ATCC 55098菌株应为同一菌株来源。

　　2.2.2.2 菌株FCZ0311及FCZ031120合成酶基因

　　进化树分析表明，FK506产生菌FCZ0311与另一株FK506产生菌Streptomyces sp. ATCC 55098具有较远的进化关系，采用上述引物PCR扩增获得2 085 bp片段，编码的2个ORF与ATCC 55098菌株的P450 C9hydroxylase和31Omethyltransferase的同源性分别仅有86.3%和87.1%。菌株FCZ031120是菌株FCZ0311通过抗生素、紫外等诱变方法筛选得到的高产菌株，但从FCZ031120菌株克隆的两个基因序列与FCZ0311菌株的相应序列完全一样，没有发现突变。

　　2.2.3 Ascomycin产生菌合成酶基因

　　Ascomycin 产生菌Streptomyces sp. FIM 260840的扩增产物与GenBank收录的Ascomycin 产生菌Streptomyces hygroscopicus subsp. ascomyceticus菌株的P450 C9hydroxylase和31Omethyltransferase基因同源性很高。其中C9hydroxylase基因仅有2个碱基差异，即第540 bp（A→G）、806 bp（C→T）位置发生碱基变换，由于密码子简并性，编码蛋白质只有第269aa发生Ser→Phe变化。克隆的31Omethyltransferase基因也只有1个密码子的第3个碱基（A39→G39）差异，其蛋白质序列完全相同。

　　2.2.4 克隆基因编码蛋白质的进化关系

　　分别以克隆的不同菌株的细胞色素P450羟化酶、甲基转移酶基因编码蛋白质序列与GenBank上相关菌株的对应序列构建分子进化树（图3，4），与16S rDNA进化关系不同，处于不同进化分支上的FK506产生菌其合成酶分子进化关系较近；Ascomycin与FK506合成酶分子进化关系相近，而与Sirolimus合成酶进化关系相对较远，虽然从菌种本身看Ascomycin产生菌与Sirolimus产生菌进化关系很近，处于同一个进化分支（图1）。

　　3 讨 论
　　
　　含氮大环内酯类免疫抑制剂FK506、Sirolimus和Ascomycin化学结构类似，其中Ascomycin与FK506结构更为接近，仅在内酯环C21位上侧链不同，分别为乙基和丙烯基，而相对Sirolimus化学结构差异较大。三者生物合成机制、合成基因簇结构也极其相似，已发现多种链霉菌能够产生此类化合物。笔者对五株不同产生菌进行基因进化分析，从其16S rDNA进化关系分析，它们分别处于三个进化分支上，从次级代谢产物合成酶基因的分子进化关系分析，处于不同进化分支的两株FK506产生菌Streptomyces sp. FCZ0311与Streptomyces sp. FIM260990分子进化关系最近，结构上仅有一个侧链基团差异的Ascomycin产生菌Streptomyces sp. FIM260840与FK506产生菌的分子进化关系相对较近，但从菌种进化关系上看前者与Sirolimus产生菌S. hygroscopicus FC904更为接近。以上结果看出，随着合成基因的进化其产物的结构差异在逐步增大，但是FK506、Sirolimus和Ascomycin等次级代谢产物合成酶基因的进化与各菌株自身的进化并不同步，代谢产物结构差异越大，其合成酶基因的进化关系越远，但是其产生菌的进化关系却可能较为接近，因此认为此类次级代谢产物合成基因并不是菌株本身固有的，而是在菌株进化过程中同属不同种微生物之间发生基因水平转移获得的。此类代谢产物合成基因簇接近100 kb，如此大片段DNA如何在不同微生物之间进行转移仍不是很清楚。
　　
　　细菌之间基因横向转移已经有很多文献报道，如一些抗性基因和代谢功能基因[11]，但是微生物次级代谢产物的生物合成基因是在自身进化过程通过水平转移获得的，还是在进化过程中初级代谢酶基因发生变异而获得的，是个很难回答的问题，相关的文献报道也很少[12]。通过比较产生菌微生物系统进化和代谢产物合成酶分子进化上的差异在一定程度上能够证明次级代谢产物合成基因水平转移的存在，说明菌株的次级代谢产物合成能力可能是在进化过程从其它产生菌中通过染色体整合、转移获得。

参考文献

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