【摘要】 目的：探讨鹿茸多肽(PAP)对大鼠软骨细胞体外增殖的影响。方法：采用二次酶消化法获得大鼠关节软骨细胞进行传代培养并对第四代细胞进行药物干预，利用MTT比色、免疫组化检测增殖细胞核抗原（PCNA）、流式细胞术检测细胞周期等方法来检测各代次大鼠软骨细胞和药物干预后第四代软骨细胞的增殖情况。结果：大鼠软骨细胞随传代培养，MTT比色显示增殖呈下降趋势，免疫细胞化学检测PCNA表达减少，流式细胞术显示细胞增殖指数下降;PAP可以抑制这一趋势，促进传代培养的细胞增殖能力。结论：PAP对传代培养的大鼠软骨细胞的增殖能力有明显促进作用。
【关键词】 鹿茸多肽；大鼠；软骨细胞；增殖
Abstract Objective: The purpose of the present was to investigate the effect of pilose antler polypeptides(PAP) on the proliferation of rat chondrocyte in vitro.Methods: The rat articular chondrocytes were isolated by enzyme digestion and sub-cultivated in serial.The 4th chondrocyte was interfered with PAP.The chondrocytes of different generations and the 4th medicine intefered generation were detected with the methods of proliferating cell nuclear antigen ， MTT(methyl thiazolyl tetrazolium) assay for proliferation and Flow cytometry for analyses of cell cycle distribution and PI(proliferation index).Results: With chondrocytes passage time increasing， the proliferating ability of chondrocytes descended.MTT assay showed that the proliferating ability of chondrocytes decreased， the expression of PCNA tapered in the experiment of immunohistochemistry， and PI descended in flow cytometry for analyses.PAP can inhibit the tendency and strengthen the proliferating ability of chondrocytes in serial subcultivation.Conclusion: PAP can significantly improve proliferation of chondrocytes in serial subcultivation.
Key words Pilose antler polypeptides(PAP); Rat; Chondrocyte; Proliferation
关节软骨缺损是临床上常见的损伤，它可导致关节面不平整，从而继发骨性关节炎。用组织工程软骨修复关节软骨缺损是目前正在尝试的一种新方法，具有良好的发展潜力。关节软骨细胞是组织工程理想的种子细胞，但如何分离获取数量多、活性高、分化良好的软骨细胞是组织工程培养技术中的重要问题之一。近年来对生长因子在关节软骨形成和退变过程中的作用日益受到重视，并开展了广泛的研究，认为种子细胞需要适应生长因子的调控才能获得良好的生物活性。由于鹿茸生长的特殊性，故人们推测鹿茸中可能存在某种活性物质控制并刺激鹿茸生长。鹿茸多肽（PAP）是从梅花鹿茸中提取的一种多肽类生物活性因子，为鹿茸的主要活性成份。因此，本研究采用体外培养大鼠软骨细胞的方法，观察PAP对其增殖的影响，为优化组织工程的种子细胞提供一定的理论和实验依据。
1 材料
1.1 实验动物 SD大鼠（闽验证字20050001，合格证号2005C03），清洁级，福建医科大学实验动物中心提供，3～4周龄，体重180～200g，皆为雄性，共8只。
1.2 主要试剂 αMEM培养基(Gibco公司)、胎牛血清（FBS，HyClone公司）；胰蛋白酶1∶250(Trypsin，Amersco公司)、Ⅱ型胶原酶(Sigma公司)、PBS(Gibco公司)；噻唑蓝（MTT，上海申能博采公司），二甲基亚砜(DMSO，Amersco公司)；增殖细胞核抗原PCNA(美国NeoMarkers公司)；PAP粉针由长春中医学院赵文海教授惠赠。
2 方法
2.1 大鼠软骨细胞的获取、鉴定与药物干预分组情况 取4周龄体重180～200g的SD大鼠，断颈处死，参考Hu等［1］软骨细胞分离培养方法进行实验，获取软骨细胞置于5%CO2混和气体环境、37℃恒温箱内单层培养，隔3日首次换液，8～10 天达85%融合后进行传代培养。以传代次数（passage，P）分组，P0即原代细胞，P1即第1次传代后细胞，P2即第2次传代培养细胞，余类推。软骨细胞鉴定采用阿力新蓝染色法检测GAG合成、免疫组化法及RT－PCR法检测Ⅱ型胶原表达［2］。实验分组为P2组、P3组、P4组及鹿茸多肽不同剂量组（低、中、高不同药物浓度干预后的P4软骨细胞组），鹿茸多肽干预组分组的方法采用传代分组法：倒置相差显微镜下进行观察，当P3代软骨细胞融合达到85%时，进行传代（1传3），以胰酶消化贴壁细胞，反复吹打，使细胞均匀悬浮，离心（1 500rpm，5分钟），洗涤2次；对αMEM（含5%FBS）进行加药，分别配制含不同浓度的PAP培养基，分别加药使各瓶培养基药物终浓度为PAP 5μg/mL、PAP 10μg/mL、PAP 15μg/mL；分别以上述不同含药浓度培养基吹打混匀各瓶P3细胞，进行传代，使药物干预组软骨细胞进入P4代。按实验要求调整细胞浓度，分别接种软骨细胞于底面积25cm2培养瓶（细胞浓度5×105/mL）、6孔培养板（置入盖玻片）（细胞浓度5×105/mL）、96孔培养板（细胞浓度4×105/mL）， 于37℃、5%CO2饱和湿度孵育箱中孵育，其中PAP分组参考剂量来源于前期实验［3］。
2.2 各代软骨细胞MTT比色试验 将不同代次大鼠软骨细胞以5×104/mL浓度接种于96孔培养板中，常规培养24小时后用含体积分数为5%FBS的αMEM培养，并分别加入PAP，使PAP终浓度为5、10、15μg/mL，加药后分别继续培养48小时 ，加入MTT溶液呈色。选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各个孔光吸收值。
2.3 各代软骨细胞周期分析及增殖指数检测 将培养的待测各代软骨细胞分别置5mL试管中，用PBS或生理盐水洗2次，制成单细胞悬液，无水乙醇固定细胞，加入PBS调整细胞浓度为5×105～5×106个细胞加入1mL DNA荧光染料（PI），室温下避光染色15分钟，以流式细胞仪(Becton Dickinson FACScan，美国)分析各代软骨细胞周期及检测增殖指数。
2.4 各代软骨细胞免疫细胞化法检测各组软骨细胞PCNA表达 将不同代次软骨细胞接种于6孔板，孔内均预置一块盖玻片，常规培养48小时后取出盖玻片，用免疫组织化学二步法检测PCNA表达情况，结果分析：采用HPIAS21000高清晰度图像处理系统进行图像分析，测定PCNA阳性信号的面积密度( Sv =PCNA阳性信号面积和/窗口面积×窗口数)。
2.5 统计学方法 以上检测均随机取多个样本，每个样本多次重复。应用SPSS11.0统计软件进行分析。进行Oneway ANOVA检验和Pearson相关分析，定量资料实验结果以均数±标准差表示，P&<0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 各组软骨细胞MTT比色结果 MTT比色分析显示：随着软骨细胞传代培养，从P2代细胞至P4代软骨细胞在传代培养过程中细胞能量代谢呈下降趋势，逐代相比OD值有显著差异（P&<0.01），PAP干预后的P4软骨细胞各组比之P4组能量代谢均有显著提高（P&<0.01），其中PAP 10μg/mL组促进能量代谢的作用最为显著（P&<0.01），见图1。
图1 各组软骨细胞在不同观察时间点的增殖情况(OD值)（略）
3.2 各组软骨细胞细胞增殖指数结果 流式细胞术实验结果显示：随着软骨细胞传代培养，从P2代细胞至P4代细胞，细胞增殖指数呈下降趋势，分别为20.9%、16.8%、12.6%，PAP干预后的P4各组细胞增殖指数高于P4细胞，分别为19.7%、21.4%、19.4%，其中PAP 10μg/mL组促进软骨细胞增殖的作用最高，见图2。
图2 各组软骨细胞细胞周期PI值（略）
3.3 各组软骨细胞PCNA检测结果 免疫细胞化学法检测各组软骨细胞PCNA表达显示：随着软骨细胞传代培养，从P2代细胞至P4代软骨细胞在传代培养过程中的阳性表达呈下降趋势，逐代相比其阳性表达有显著差异（P&<0.01），PAP干预后的P4软骨细胞各组比之P4组PCNA阳性表达有显著提高（P&<0.01），其中PAP 10μg/mL组促进PCNA阳性表达的作用最为显著（P&<0.01），见图3、图4。
图3 各组软骨细胞PCNA表达（略）
A：P2(×400)，B：P3(×400)，C：P4(×600)，D：PAP 10μg/mL(×400)
图4 各组软骨细胞PCNA阳性表达面积密度比值（略）
4 讨论
鹿茸具有很强的壮肾阳、益精血、强筋骨的作用，是重要的滋补强壮中药。从药理上分析，鹿茸内含有丰富的多糖类、氨基酸类、脂肪酸类物质以及多种生长因子及其它营养成分，可以为软骨细胞的生长提供充足的营养条件。鹿茸是一种特殊的骨组织，在春季生发季节以1～2cm/d的速度生长，故推测鹿茸中可能存在生长因子促进骨质和表皮层的增殖。目前王本祥研究室应用凝胶过滤和离子交换层析等技术，从梅花鹿茸中分离纯化出一种多肽，经高效液相色谱和N-末端氨基酸分析鉴定为单一多肽，氨基酸组成分析证明，PAP是由68个氨基酸残基组成，分子量为7 200［4］。此多肽主要含有缬氨酸、丙氨酸、赖氨酸和甘氨酸，没有半胱氨酸。实验证明PAP具有很强的促进骨、软骨细胞增殖的作用［5-6］。实验所见软骨细胞在体外传代培养过程中细胞增殖能力呈下降趋势，本实验从MTT比色分析细胞能量代谢，流式细胞术考察其增殖期细胞含量，免疫细胞化学法检测增殖细胞核抗原表达等方面看到从P2代细胞至P4代细胞，软骨细胞增殖能力明显下降，如何以生长因子刺激促进软骨细胞的增殖能力对于将软骨细胞作为种子细胞用于软骨组织工程具有积极意义。生长因子对靶细胞的调控与其剂量密切相关，因此，确定能产生最佳调控软骨细胞增殖的PAP剂量至关重要。本文在预实验的基础上用MTT比色试验所筛选的不同剂量的PAP能不同程度地促进软骨细胞的能量代谢。说明PAP能促进软骨细胞增殖，而且以10μg/mL浓度为最佳。PCNA是一种仅在增殖细胞中合成或表达的核内多肽，其表达和合成与细胞周期有关。主要表达增殖细胞的S期、G1期、G2初期，因此成为检测细胞增殖活性最为有效的标志之一。本实验免疫组化结果证实，PAP以10μg/mL浓度时软骨细胞表达致密的棕褐色颗粒最多，其他组则较少，说明PAP可通过促进PCNA表达来调控DNA复制。细胞周期与细胞中DNA含量密切相关，DNA含量随着细胞周期各期而发生变化。当细胞受到某些因素刺激时，可使DNA含量发生变化，从而引起细胞周期发生改变。细胞增殖指数是S期与G2期DNA含量之和与S期、G2及G1期DNA含量之和的比，它是反映细胞增殖的重要指标之一。本实验FCM结果显示，PAP能显著提高软骨细胞增殖指数，且以10μg/mL浓度时最明显。综上所述，PAP不仅具有显著的生物活性，可以促进软骨细胞的增殖，而且还能阻止软骨细胞在连续体外培养过程中的增殖衰老趋势，本实验可以为优化组织工程中的种子细胞提供一定理论和实验依据，有关PAP抗软骨细胞传代老化的实验有待进一步探讨。
参考文献
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［4］ Zhang ZQ，Zhang Y，Wang BX，et al.Purification and Partial Characterization Of Anti-inflammatary Peptide from Pilose Antler of Cervus Nippon temminck［J］.Acta Pharmaceutica Sinica ，1992，27(5):321-324.
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