蝙蝠葛酚性碱对BXPC3裸鼠抑瘤作用及对VEGF表达的影响

　　　　 作者：苏云明，李薇婕，李宜航，刘坤，孟丹，章艳，崔艳

【摘要】 目的 研究蝙蝠葛酚性碱(PAMD)对BXPC3裸鼠抑瘤作用及对肿瘤新生血管内皮因子(VEGF)表达的影响，并进一步探讨其作用机制。方法 建立BXPC3裸鼠的动物模型，检测蝙蝠葛酚性碱对转移瘤的抑瘤率，采用免疫组织化学方法检测各组BXPC3小鼠肿瘤组织 VEGF的表达水平。结果 蝙蝠葛酚性碱对BXPC3胰腺癌裸鼠瘤组织具有一定的抑制作用，与模型对照组比较具有统计学意义(P &<0.01)。PAMD各剂量均能明显降低BXPC3胰腺癌裸鼠瘤组织VEGF的表达水平。结论 蝙蝠葛酚性碱对BXPC3裸鼠胰腺癌具有明显的抑制作用。其机制可能是通过改善裸鼠免疫功能，抑制肿瘤新生血管形成来实现的。

【关键词】 蝙蝠葛酚性碱;VEGF;免疫组织化学;BXPC3

　　【Abstract】 Objective To explore the effects of phenolic alkaloids from menispermum dauricum(PAMD)on tumor inhibitory and expression of basic fibroblast growth factor(VEGF)in BXPC3 nude mice and to further investigate its protective mechanism for pancreatic carcinoma.Methods The metastatic tumor model of nude mice was established with BXPC3 cell line.After PAMD treatment，the inhibition rate of tumor proliferation was detected and immunohistochemistry was carried out to confirm the expression of VEGF in nude mice.Results PAMD could inhibit the tumor growth of tumorbearing mice of BXPC3 cell line(P&<0.01，vs control group).Meanwhile，PAMD of different doses could inhibit the expression of VEGF in tumor tissue of nude mice.Conclusion PAMD shows conspicuous inhibitory action on the tumor growth of nude mice，which possibly due to its potency to improve immune function and inhibit tumor angiogenesis in nude mice.

　　【Key words】 phenolic alkaloids from menispermum dauricum;vascular endothelial growth factor;immunohistochemistry;BXPC3

　　胰腺癌是消化系统恶性程度高、预后最差的肿瘤，其发病率有逐年增多的趋势。由于早期缺乏敏感和特异的诊断指标，症状缺乏特异性，易发生早期转移，其侵袭性的分子机制仍不清楚，因此胰腺癌在临床中难以早期诊治，绝大多数患者在确诊时已属晚期，其外科手术切除率很低，术后生存率亦很低[12]。本实验采用胰腺癌BXPC3细胞株建立裸鼠胰腺癌模型，观察PAMD的抑瘤作用及其对肿瘤新生血管的影响，探讨其抗肿瘤作用机制及在肿瘤治疗中的应用价值，现将研究结果报道如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物

　　裸鼠，体重18～22 g，雌雄各半，由黑龙江中医药大学安全性评价中心提供，合格证:SCXK(京)20070001.裸鼠自由进食、饮水，在黑龙江中医药大学药物安全性评价中心无菌条件下饲养。

　　1.2 药物与试剂

　　蝙蝠葛酚性碱(PAMD)，黑龙江中医药大学药学院王栋教授提供，含量为83%，用时先以1 mol/L HCl溶解，再用1 mol/L NaOH调pH值至中性，加蒸馏水至所需浓度。实验时临时配制成溶液;注射用环磷酰胺(Cyclophosphamide For Injection)，江苏恒瑞医药股份有限公司，批准文号:国药准字H32020857;生理盐水，哈药集团制药六厂，批号:071003B11.

　　胰腺癌瘤株BXPC3由中国科学院上海生科院细胞资源中心提供。VEGF兔抗鼠多克隆抗体、山羊抗兔IgG抗体HRP多聚体、SP9003检测试剂盒、PV6001两步法检测试剂盒、DAB显色剂均由南京建成生物技术有限公司生产。

　　1.3 主要实验仪器

　　生物组织包埋机(湖北孝感);电热恒温箱培养箱DPX9162B1;轮转式组织切片机俫佧2135型;研究用生物显微镜Olympus BX60;电子天平(AL204，METTLEY TOLEDO，Switzerland);超净工作台BIOLOGICAL Safety Cabinets Class Ⅱ Nikon digital camera DXm1200F HⅢE600;格兰仕中型机型微波炉WP700.

　　1.4 动物模型的构建

　　取冻存的胰腺癌细胞株BXPC3，立即投入37 ℃水中，1 min内融化，然后离心去冻存液，用约10倍的冷RPMI1640完全培养液洗1次，接种于培养瓶，待细胞贴壁后更换培养液。将肿瘤细胞株培养在RPMI1640完全培养液中，置于37 ℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱中，隔日换液，细胞长成单层后，用0.25%胰酶EDTA消化、传代。待细胞进入对数生长期后，收集细胞并用RPMI1640完全培养基调整浓度为5×106个/ml的细胞悬液备用。在无菌条件下接种于40只裸鼠右腋窝皮下，每只鼠接种0.2 ml(含瘤细胞数1×106个).

　　1.5 分组及给药方法

　　裸鼠40只造模后随机分为5组，每组8只，分别为蝙蝠葛酚性碱高、中、低剂量组及阳性对照组、模型对照组。各组均腹腔注射给药，每日给药剂量为蝙蝠葛酚性碱高剂量20 mg/kg，中剂量10 mg/kg，低剂量5 mg/kg，模型对照组每日给予同等容积生理盐水，阳性对照组注射用环磷酰胺156 mg/kg(每周给药1次)，连续21 d.

　　1.6 实验指标的检测方法

　　停药后次日称取小鼠体重，脱椎处死小鼠，取瘤块称重，计算抑瘤率。免疫组化法(SP)检测肿瘤组织VEGF表达情况，检测以细胞浆内出现棕黄色颗粒者为阳性细胞，同一显微镜倍数(×40)观察全片，确定肿瘤浸润边缘。然后选择5个高倍(×400)视野，取所分析的5个不同视野染色细胞平均百分数及平均染色强度评分，评分标准按Mattern[3]的方法进行:根据着色细胞的比例(染色范围)及染色强度，染色范围(阳性细胞比率)分为0～4级，阴性为0分;阳性细胞1%～25%为1分;阳性细胞26%～50%为2分;阳性细胞51%～75%为3分;阳性细胞76%～100%为4分。染色强度划分为0～3级:无色为0分;弱阳性(黄色)为1分;中等强度(棕黄色)为2分;强阳性(棕褐色)为3分，两者得分相加为最后评分。

　　1.7 统计方法

　　抑瘤实验结果以±s表示，组间比较用t检验。免疫组织化学结果采用秩和检验计算，以P &<0.05为差异具有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 蝙蝠葛酚性碱对BXPC3裸鼠的体内抑瘤作用

　　表1实验结果表明，蝙蝠葛酚性碱高、中、低剂量组和环磷酰胺对照组同模型组比较，对BXPC3实体瘤均有不同程度的抑制作用，抑瘤率分别为34.91%，52.83%，41.51%，55.66%，并与模型组比较其差异有统计学意义(P &<0.01)。表1 蝙蝠葛酚性碱对BXPC3裸鼠抑瘤作用结果(n=8)

　　2.2 蝙蝠葛酚性碱对BXPC3裸鼠瘤组织中VEGF表达的影响

　　表2免疫组织化学结果显示:VEGF在模型组瘤组织呈高表达，各实验组和阳性对照组肿瘤组织VEGF的表达水平均较模型组有所降低;其中中剂量组和环磷酰胺组的VEGF表达水平显著降低，与模型组比较差异有统计学意义(P&<0.01);高剂量和低剂量组也能降低VEGF的表达，与模型组比较差异有统计学意义(P &<0.05)。表2 蝙蝠葛酚性碱对BXPC3裸鼠肿瘤VEGF表达水平的影响(n=7)

　　3 讨论

　　蝙蝠葛酚性碱对肿瘤的作用日渐被人们所关注，单保恩等[4]证实PAMD对多种不同组织来源的肿瘤细胞(上皮源性、血源性、腺源性)具有广谱的抑制作用。本实验抑瘤实验结果显示:PAMD高、中、低剂量组的平均瘤重均明显低于模型对照组(P &<0.01)，抑瘤率分别为34.91%、52.83%、41.51%，抑瘤率均大于30%，可初步认为PAMD对胰腺癌细胞株BXPC3裸鼠皮下异位移植瘤有一定的抑制作用。

　　1971年，Folkman[5]最早提出了肿瘤生长依赖血管新生的假说，在许多肿瘤组织中VEGF呈高表达，并且其表达水平的高低与肿瘤的某些生物学行为有密切关系[6]。VEGF作为一种生长因子，由于具有促进多种细胞生长和繁殖以及促血管生成等作用，与肿瘤的生长、增殖密切相关[78]。大量临床研究显示VEGF的高表达与肿瘤微血管密度、恶性程度、患者预后不良密切相关[912]。提示两者及其受体可作为抗血管生成以治疗胰腺癌的靶点，或监测疗效的指标。本实验结果表明:蝙蝠葛酚性碱能够下调BXPC3裸鼠肿瘤组织中VEGF表达水平，说明蝙蝠葛酚性碱可能是通过抑制VEGF的表达从而抑制肿瘤血管生成来实现抑瘤作用。

参考文献

　[1]Murr MM，Sarr MG，Oishi AJ，et al.Pancreatic cancer[J].CA Cancer J Clin，1994，44(5):304318.

　　[2]Baumel H，Huguier M，Manderscheid JC，et al.Results of resection for cancer of exocrine pancereas:a study from the French Association of Surgery[J].Br J Surg，1994，81(1):102107.

　　[3]Mattern J，Koomagi R，Volm M.Association of vascular endothelial growth factor expression with intratumoral microvessal density and tumoral proliferation in human epidermoid lung carcinoma[J].Br J Cancer，1996，73(2):931934.

　　[4]单保恩，梁文杰，任凤芝，等.中药北豆根抗肿瘤活性的体外实验[J].癌变·畸变·突变，2004，16(5):293295.

　　[5]Folkman J.Tumor angiogenesis:therapeutic implications[J].N Engl J Med，1971，285(21):11821186.

　　[6]Kato Y，Asano K，Mogi T，et al.Clinical significance of circulating vascular endothelial growth factor in dogs with mammary gland tumors[J].Vet Med Sci，2007，69(1):7780.

　　[7]Smith X，Fox SB，Wbitehouse K，et al.Up regulation of basic fibroblast growth factor in breast carcinoma and its relationship to vascular density，oestrogen receptor，epidermal growth factor receptor and survival[J].Ann Onco1，1999，10(6):707713.

　　[8]Kang DH，Joly AH，Oh SW，et al.Impaired angiogenesis in the remnant kidney model:potential role of vascular endothelial growth factor and thrombospondin1[J].J Am Soc Nephrol，2001，12(7):14341447.

　　[9]Hotz HG，Hines OF，Hotz B，et al.Evaluation of vascular endothelial growth factor blockade and matrix metalloproteina inhibition as a combination therapy for experimental human pancreatic cancer[J].J Gastrointestinal Surg，2003，7(2):22228.

　　[10]Manders P，Beex LV，TjanHeijnen VC，et al.Vascular endothelial growth factor is associated with the efficacy of endocrine therapy in patients with advanced breast carcinoma[J].Cancer，2003，98(10):21252132.

　　[11]刘晓谦，张锟，王雪峰，等.VEGF、bFGF、PTEN表达与胶质瘤恶性程度及预后因素的研究[J].中华神经外科杂志，2004，20(1):1417.

　　[12]吴宜林，刘毅智，李玲.卵巢恶性肿瘤VEGFmRNA和bFGFmRNA的表达及其意义[J].湖南医科大学学报，2000，5(4):406408.