反相高效液相色谱法测定银翘感冒袋泡剂中绿原酸的含量

　　　　　　 作者：梁学政，吕建伟，唐勇琛

【摘要】 目的 建立银翘感冒袋泡剂中绿原酸的含量测定方法。方法 采用反相高效液相色谱法对银翘感冒袋泡剂中绿原酸进行定量分析，色谱柱为Shimpack vpods C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇三乙胺冰醋酸水（20∶0.3∶1∶86）；检测波长：324 nm；柱温：30℃；流速1.0 ml.min-1；进样量：20 μl。结果 绿原酸在0.1016～3.0480 μg范围内呈良好的线性（r=0.9999，n=6），平均回收率为100.28％，RSD为1.57％（n=6）。结论 本方法准确、可靠、重现性好，可有效控制该制剂的质量。

【关键词】 银翘感冒袋泡剂；绿原酸；反相高效液相色谱法

　　【Abstract】 Objective To study a method to determine caffeotannic acid in Yinqiaoganmao Species by RPHPLC.Methods The caffeotannic acid in Yinqiaoganmao species was detected by RPHPLC .The column consisted of Shimpack vpods C18 column (250 mm×4.6 mm，5 μm).The mobile phase were CH3OH(C2H5)3NCH3COOHh3O（20∶0.3：1∶86），flow rate was 1.0 ml·min-1，the UV detection wavelength was 324 nm，the column temperature was 30℃.Results The caffeotannic acid was in good linearity over the range of 0.1016～3.048 μg（r=0.9999，n=6） with an average recovery of 100.28％，the RSD was 1.57％（n=6）.Conclusion This method is accurate、convenient、reproducible，which can be used to control the quality of Yinqiaoganmao Species.

　　【Key words】yinqiaoganmao species;caffeotannic acid;RPHPLC

　　银翘感冒袋泡剂是在我院临床经验方的基础上研制而成，由金银花、薄荷、连翘等9味中药组成，具有辛凉解表、清热解毒之功效，主要用于治疗风热感冒、咽喉疼痛、咳嗽口干等，金银花为方中君药，绿原酸是其主要化学成分。为提高质量标准，达到更有效地控制该制剂内在质量的目的，本文建立以反相高效液相色谱法测定银翘感冒袋泡剂中绿原酸含量的方法。

　　材料和方法

　　1.仪器

　　岛津LC20A型高效液相色谱仪（SPD20A紫外检测器、LCSolution色谱工作站），Mettler toledo型电子分析天平（瑞士Metter公司）；CQX256型超声波清洗机（中国北京创新德超声电子研究所）。

　　2.试药

　　绿原酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110753200413）；银翘感冒袋泡剂（批号：090603，090610，090618，090626，090702，090712，本院自制）；甲醇为色谱纯；三乙胺、冰醋酸为分析纯；水为纯净水。

　　2.方法

　　（1）色谱条件 色谱柱：Shimpack vpods C18(250 mm×4.6 mm，5　μm)；流动相：甲醇三乙胺冰醋酸水（20∶0.3∶1∶86）；检测波长：324 nm；柱温：30℃；流速1.0 ml.min-1；进样量：20　μl。理论塔板数按绿原酸峰计算应不低于3000。

　　（2）对照品溶液的制备 精密称取绿原酸对照品适量，置25 ml量瓶中，加50％甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，以配成0.508 mg·ml-1的对照品溶液，备用。

　　（3）供试品溶液的制备 取10小袋样品，倾出内容物，研细，取细粉1.00 g，精密称定，置50 ml量瓶中，加50％甲醇40 ml，超声（260 W，频率40 kHz）处理30 min，放冷，加50％甲醇至刻度，摇匀，微孔滤膜（0.45　μm）滤过，即得。

　　（4）阴性对照品溶液的制备 以相同的处方比例取除金银花外的药材，按供试品溶液的制备方法制备阴性对照品溶液。

　　（5）线性关系考察 精密吸取对照品溶液0.25，0.50，1.50，3.00，5.00，7.50 ml，置25 ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取20　μl进样，以对照品峰面积值为纵坐标(Y)，对照品的量为横坐标(X），进行线性回归，得回归方程为Y=3075.2X+32.391，r=0.9999（n=6）。结果表明绿原酸进样量在0.1016～3.0480 μg范围内呈良好的线性。

　　（6）阴性干扰实验

　　分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各20　μl进样测定。结果供试品溶液中在与对照品溶液相同位置上具有同一保留时间的色谱峰，而阴性对照品溶液对测定无干扰。见图1。

　　 （7）精密度试验

　　精密吸取同一对照品溶液20　μl，重复进样6次。测得峰面积的RSD为1.02％（n=6），表明精密度良好。

　　（8）稳定性试验

　　取同一供试品溶液20　μl，分别于0，2，4，6，8，12 h 进样，测得绿原酸的峰面积的RSD为1.05％，表明供试品溶液中绿原酸至少在12　h内稳定。

　　（9）重复性试验

　　取同一批供试品6份，精密称定，制备供试品溶液，进样20 μl，测定绿原酸的含量，结果其含量的RSD为0.73％（n=6），表明方法的重复性良好。

　　（10）回收率试验

　　取已知含量的供试品6份，精密称定，分别精密加入0.508 mg·ml-1的绿原酸对照品溶液2.0 ml，按供试品制备方法制备供试液，进样，记录色谱图，计算回收率。结果平均回收率为100.28％，RSD为1.57％，表明回收良好。见表1。表1 绿原酸回收率试验及结果（略）

　　结 果

　　精密称取6个批号的样品各适量，按供试品制备方法制备样品溶液，在色谱条件下测定，用外标法计算绿原酸含量。结果批号为090603，090610，090618，090626，090702，090712的样品中绿原酸含量分别为2.835，2.852，2.906，2.867，2.793，2.784 mg/袋，平均为2.840 mg/袋。回收率试验平均回收率为100.28％，RSD为1.57％，表明回收良好。

　　讨 论　　

　　1.提取方法的确定

　　由于绿原酸极不稳定且极性较大，参考中国药典［1］并结合指标成分的理化性质，我们比较了热回流提取和超声提取两种方法，发现超声提取较为完全且不影响指标成分的分解，利于控制该制剂的质量。

　　2.提取溶剂的选择

　　采用甲醇、乙醇、水作为提取溶剂，通过比较单一溶剂和混合溶剂，最后选定50％甲醇溶液作为最佳提取溶剂。

　　3.提取时间的确定

　　考察了超声提取时间的影响，结果发现超声处理20、30、40 min差别不大，为了提取完全同时又节约时间，故选择超声提取30 min为宜。

　　4.检测波长的选择

　　取绿原酸对照品适量，加50％甲醇使之溶解，在200～400 nm范围内进行紫外扫描，结果绿原酸在324　nm波长处有最大吸收，因此选择324 nm为检测波长。

　　5.色谱系统的选择

　　比较了甲醇三乙胺冰醋酸水（18∶0.3∶1∶85）、乙腈0.3％磷酸溶液（9∶91）［1］、乙腈0.4％磷酸溶液（10∶100）［2］三个不同组分、不同比例的流动相，最终发现在甲醇三乙胺冰醋酸水（20∶0.3∶1∶86）的色谱条件下，绿原酸与其他组分分离较好（分离度大于1.5，理论塔板数大于3000），且阴性无干扰。

参考文献