二苯乙烯苷对SAMP8鼠脑组织胆碱能及单胺类神经递质的影响

　　　　作者：黄忠仕，黎昀，黄健，李曙波，农嵩

【摘要】 目的 观察二苯乙烯苷(TSG)对SAMP8鼠脑组织胆碱能神经递质及单胺类神经递质含量的影响。方法 选用6月龄的SAMP8鼠50只，随机分为5组，SAMP8对照组、阳性药石杉碱甲对照组、TSG低、中、高剂量组，每组10只。另选用6月龄SAMR1鼠10只作正常对照组。各组分别灌胃相应药物50天后，采用分光光度法检测各组小鼠脑组织胆碱乙酰转移酶（ChAT）和乙酰胆碱酯酶（AchE）活性，高效液相色谱法检测各组小鼠脑组织去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）、5羟色胺（5HT）含量。结果 SAMP8对照组脑组织ChAT活性明显降低，AchE活性明显升高，NE、DA、5HT的含量明显降低，与正常对照组比较有显著性差异（P＜0.05或0.01）；TSG中、高剂量组ChAT活性显著升高，TSG各剂量组AchE活性显著降低（P＜0.05或0.01），NE、DA、5HT含量均得到提高，与SAMP8对照组比较，差异具有显著性（P＜0.05或0.01）。结论 二苯乙烯苷可有效促进乙酰胆碱（Ach）的合成及减少乙酰胆碱的分解，促进单胺类神经递质的合成，具有良好的抗痴呆的作用。

【关键词】 二苯乙烯苷；老年性痴呆；胆碱能神经递质；单胺类神经递质

　　【Abstract】 Objective To observe the effect of TSG on cholinergic neurotransmitter and monoamine neurotransmitter contents in SAMP8 mice's brain.Methods 50 mice of 6 month's old with SAMP8 were randomized pided to 5 groups (10 in each group):SAMP8 group，huperzine A control group，low，midand highdose groups of TSG. Another 10 mice were assigned to normal control group. After medication for 50 days，the activity of ChAT，AchE in mice's brain in each group were detected by spectrophotometry.The NE，DA and 5HT contents in brain were detected by HPLC.Results The activity of ChAT decreased and the activity of AchE enhanced significantly， and the NE，DA and 5HT contents decreased significantly in SAMP8 mice's brain comparing with normal group(P＜0.05 or 0.01). In TSGtreatment group，the activity of ChAT enhanced and the activity of AchE decreased significantly，and the NE，DA and 5HT contents increased significantly in mice's brain comparing with SAMP8 group (P＜0.05 or 0.01).Conclusion TSG can effectively promote the synthesis of acetylcholine and reduce the decomposition of acetylcholine， promote the synthesis of monoamine neurotransmitter， resulting in the satisfactory antidementia effects.

　　【Key words】 2，3，5，4′tetrahydroxystilbene2OβDglycoside (TSG);alzheimer disease;cholinergic neurotransmitter;monoamine neurotransmitter

　　阿尔茨海默病，即老年性痴呆（alzheimer eisease，AD）是危害老年人身心健康的常见病、多发病。目前该病的发病机制尚未明确，研究发现AD与脑内多种神经递质密切相关［1，2］。二苯乙烯苷（2，3，5，4'四羟基二苯乙烯βD葡萄糖苷，TSG）是何首乌中的主要水溶性成分，近年来发现其具有神经保护作用，对老年性痴呆的防治具有很好的应用价值［3，4］。本实验从何首乌提取TSG成分，以SAMP8（senescence accelerated mouse prone/8，快速老化小白鼠）为老年性痴呆动物模型，考察二苯乙烯苷对SAMP8鼠脑组织胆碱能及单胺类神经递质的影响，报道如下。

　　材料和方法　　

　　1.动物

　　SAMP8和SAMR1（senescence acceleratedresistant mouse/1， 正常老化小白鼠）雄性小鼠由天津中医学院第一附属医院提供（实验动物质量合格证号：WJ津实动质M准字第006号），SPF级，体重24～28 g。

　　2.主要试剂

　　ChAT（胆碱乙酰转移酶）、AchE（乙酰胆碱酯酶）、T.P(总蛋白)测试盒由南京建成生物工程研究所提供。标准品：去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5羟色胺(5HT)标准品（Sigma公司生产）；流动相：甲醇、乙腈（天津市四友精细化学有限公司生产，批号：Q/SHIELD0022000）；磷酸氢二钠（广东合山化工厂生产，批号：20060801）；样品前处理试剂：高氯酸（广东爱廉化试剂有限公司生产，批号：060508）；阳性对照药：石杉碱甲（豫中制药厂生产，批号：H10940156）；二苯乙烯苷（由右江民族医学院生化教研室根据有关文献［5，6］提取，纯度为73%）。

　　3.实验仪器

　　TU1800 SPC紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；RA50半自动化分析仪（Bayer Diagnostics Mfg. Ltd）；FJ200高速分散匀质机（上海标本模型厂）；Waters1525高效液相荧光检测器（美国Waters公司）；C18（4.6×250　mm，5　μm）色谱柱（Agilent公司）；高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）。

　　4.方法

　　（1）动物分组与给药

　　选择6月龄SAMP8雄性鼠50只，随机分为SAMP8对照组、阳性药石杉碱甲对照组、TSG低剂量组、TSG中剂量组、TSG高剂量组，每组10只。另外选择6月龄SAMR1雄性鼠10只，作为SAMRl对照组。各组均按0.2 ml/10 g体重给药。SAMP8对照组、SAMRl对照组：生理盐水，30　ml·kg-1；阳性药对照组：石杉碱甲0.02 mg·kg-1；TSG低剂量组：TSG 0.033 g·kg-1；TSG中剂量组：TSG 0.1 g·kg-1；TSG高剂量：TSG 0.3 g·kg-1。以上各组每日灌胃给药l次，连续50天。

　　（2）标本采集

　　第50天给药1小时后处死小鼠，同时迅速剥离小鼠脑组织于4℃预冷的生理盐水漂洗除去血液，用滤纸吸干多余水分，分离左右半脑并分别称重，左半脑用于ChAT、AchE、T.P测定，右半脑用于NE、DA、5HT测定。

　　（3）ChAT、AchE、T.P的测定

　　分取出各组小鼠左半脑，分别加入9倍体积的冰生理盐水，用高速分散匀质机制成10%的脑匀浆，3000 r·min-1离心10 min，取上清液待测。按试剂盒操作说明分别对各组小鼠脑匀浆上清液进行ChAT、AchE、T.P测定。各组小鼠ChAT、AchE活性除以相应的T.P含量作为ChAT、AchE的单位。

　　（4）单胺类神经递质标准曲线的制备

　　精密称取NE、DA、5HT标准样品各0.01 mg，分别用流动相定容于5 ml容量瓶中，制成0.002 g·L1的NE、DA、5HT的贮存液。按需要稀释成各种浓度进样，每次进样20 μl，以进样浓度（X，μg·L-1）对峰面积（Y）进行线性回归。

　　（5）单胺类神经递质测定方法

　　取出各组小鼠右半脑，分别加入9倍量（重量/体积比）5%HClO4，超声粉碎成10%匀浆，冷冻高速离心14000 r·min-1 15分钟，取上清液进样20 μl。记录各样品的峰面积，代入相应标准曲线计算出相应浓度，统计结果。色谱条件：色谱柱为Waters symmetry C18（4.6×250　mm，5　μm）；流动相A：磷酸盐缓冲液；流动相B：甲醇；时间与流速：0～10 min 0.5 ml·min-1，10～14 min1.0　ml·min-1，14～22.5 min 1.5 ml·min-1，22.5～30 min 0.5 ml·min-1；A和B泵的比例：90∶10；AUFS：0.01；波长：激发波长254 nm，发射波长338 nm；柱温：35℃。

　　5.统计学处理

　　采用SPSS 11.0统计软件包统计分析，计量资料以均数±标准差（-±s)表示，组间比较采用两独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

　　 结　　果

　　 1.二苯乙烯苷对ChAT和AchE活性的影响 与SAMR1对照组相比，SAMP8对照组ChAT活性明显降低，AchE活性明显升高(P＜0.05)。与SAMP8对照组相比，TSG中、高剂量组ChAT活性显著升高，TSG各剂量组AchE活性显著降低（P＜0.05或0.01）。与阳性药对照组比较，TSG各剂量组无显著性差异（P＞0.05）。见表1。表1 二苯乙烯苷对ChAT和AchE活性的影响（略)注：与SAMR1对照组比较，ΔP＜0.05；与SAMP8对照组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

　　2.NE、DA、5HT含量的标准曲线制备

　　根据标准曲线求得其回归方程为：Y=515.6X-38171.9，Y=329.3X-34557.2和Y=342.4X+534.5；线性范围分别125～2000 μg·L-1，125～4000 μg·L-1和10～500 μg·L-1。

　　3.二苯乙烯苷对三种单胺类神经递质含量的影响

　　与SAMR1对照组和阳性药对照组相比，SAMP8对照组动物NE、DA、5HT含量水平明显下降(P＜0.05或0.01)。与SAMP8对照组相比，二苯乙烯苷各剂量组能明显升高NE、DA、5HT水平(P＜0.05或0.01)，其中以高剂量组作用更明显(P＜0.01)。见表2。表2 二苯乙烯苷对三种单胺类神经递质含量的影响（略)注：与SAMR1组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；与SAMP8组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

　　讨 论　　

　　AD是一种以认知功能下降为特征的神经退行性病变，累及多种神经递质系统，其中胆碱能系统活性下降是引起AD痴呆表现的重要原因之一 。研究表明，AD脑内隔区、Meynert基底核等部位的胆碱能神经元明显减少，AD患者脑内乙酰胆碱（Ach）合成分泌减少，其合成酶ChAT活性下降，且与痴呆严重程度密切相关［7，8］。AchE是催化Ach水解的主要生物酶，研究证实AD脑内一方面正常神经元内AchE活性降低，另一方面，神经纤维缠结（NFT）和老年斑（SP）内游离于神经元外的AchE活性显著提高，它们可大量水解Ach，使皮质Ach活性进一步降低［9］。而脑内Ach含量降低，AchE活性升高，M和N胆碱受体数量减少均可能造成认知功能障碍。

　　认知机制不仅与胆碱能神经系统密切相关，而且与单胺类神经递质NE、DA、5HT密切相关。正常情况下，中枢内神经递质的分泌保持在一定水平，它们之间相互制约处于一种平衡状态，从而维持功能的稳定［10］。研究表明，脑内单胺类神经递质NE、DA、5HT等在学习记忆等方面具有重要作用，NE主要在记忆保持方面起作用，而改善记忆与促进DA释放有关，5HT系统则参与调节情绪、动机和食欲等［11］。随着机体的老化，会出现学习记忆能力的下降，同时脑内单胺类神经递质的代谢亦发生紊乱，导致NE、DA、5HT含量的下降，出现痴呆和忧郁等症状［12］，而改善中枢单胺类神经递质的代谢可弥补或扭转学习记忆的障碍［13］。

　　本组实验结果显示，与SAMR1对照组相比，SAMP8对照组ChAT活性明显降低，AchE活性明显升高，单胺类神经递质NE、DA、5HT的含量均明显下降。而经二苯乙烯苷治疗后，TSG各剂量组的ChAT活性明显升高，AchE活性明显降低， NE、DA、5HT的含量均明显提高。提示二苯乙烯苷可促进Ach合成，减少Ach分解，并有效调整中枢单胺类神经递质的合成，通过影响中枢胆碱能神经系统和单胺类神经递质的功能而发挥抗痴呆作用。

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