氧化低密度脂蛋白测定方法的探讨

　　　　 作者：汪咏新，热阳古力·努尔麦麦提，廖洪利，姑丽娜尔·依明，田刚

【摘要】 目的 探讨建立共扼双烯法（CD）测定氧化低密度脂蛋白（OXLDL）对临床诊断的指导意义。方法 采用改进分离低密度脂蛋白的方法，应用CD法与国内通用的ELISA法平行对比，经检测急性心肌梗死（AMI）、不稳定性心绞痛（UAP）、稳定心绞痛（SAP）患者各30例，并与健康人30例比较。结果 ELISA法检测OXLDL的结果与CD法之间无相关性，各疾患组血清中LDL氧化形成CD的延迟期显著短于对照组（P均＜0.01）。结论 阻断LDL的氧化可能成为预防或治疗此类疾患的手段之一。

【关键词】 氧化低密度脂蛋白；共扼双烯法；ELISA法

国外近年研究表明，促动脉硬化的低密度脂蛋白（LDL）可在体内由多种因素形成氧化低密度脂蛋白（OxLDL），从而明显增强其促动脉硬化及促凝的作用。体内OxLDL升高与缺血性心、脑血管病及多种老年病关系密切，已成为国内外医学关注的焦点问题。本研究建立了体外LDL氧化产物共扼双烯(CD)检测法［1］，并对急性心肌梗死（AMI）、不稳定性心绞痛（UAP）、稳定心绞痛（SAP）患者各30例、及健康人30例的氧化易感性进行分析，以探讨应用此方法检测OXLDL的可靠性。

　　资料与方法

　　1.观察对象

　　急性心肌梗死(AMI)患者30例，不稳定性心绞痛(UAP)患者30例，稳定心绞痛（SAP）患者30例，均符合WHO1999年诊断标准。取体检及化验指标均正常的30例健康人作为对照组，各组对象均男女各半，年龄在50～65岁，均同时空腹静脉取血，冷冻备用。

　　2.主要试剂

　　CuS04分析纯；pH 7.4的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)；溴化钾(天津化学试剂三厂出品)；ELISA测定OxLDL试剂盒；氨基黑10B（AR 北京化学试剂厂）；油红“0”（MERCK）。

　　3.方法

　　（1）脂蛋白的分离制备与纯度鉴定

　　清晨空腹静脉采血，常规分离血清。每3 ml血清加入约1 g固体溴化钾（KBr），此时血清密度为1.30 g/ml，在BeckmanT：60转头离心管中铺制不连续密度梯度，于10 C超速离心，175 000 g（50 000 rpm），3 h［2］。小心吸取出LDL组分，与人血清分别同时进行琼脂糖电泳，分别依氨基黑10B和油红“0”染蛋白质和脂质。

　　（2）酚试剂法蛋白质定量测定方法参照文献［3］。

　　（3）LDL的氧化修饰 调整脂蛋白浓度为0.05 g/L，加入CuSO4溶液（终浓度10 mol/L）37℃每隔5分钟于波长234 nm测吸光度值共5小时［4］。

　　4.统计学处理

　　实验数据均采用SPSS 10.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（ -±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验，相关性检验采用直线相关分析，P＜0.05表示有统计学意义。

　　结果　　

　　1.不连续密度梯度溶液铺制及离心结果

　　顶层乳状液下有一压缩成细带的桔黄色液体，该液体即为LDL，其与顶层的VLDL及下层的高密度脂蛋白（HDL）分界清楚，间有相当距离。分离获得的LDL与血清分别同时进行琼脂糖电泳，经氨基黑10B和油红“0”分别染色后，人血清可见多条染色带，而LDL均只见在相应β脂蛋白位置呈现单一染色带。表明分离的样品已达到琼脂糖电泳纯程度。

　　2.LDL氧化过程曲线

　　脂蛋白内多聚不饱和脂肪酸（PUFAS）被氧化形成共扼双烯（CD），于波长234 nm处有最大吸收峰，用紫外分光光度计连续监测急性心肌梗死（AMI），不稳定性心绞痛（USP）、稳定性心绞痛（ASP）及正常人共120例LDL氧化修饰过程中CD量随时间变化情况，比较其延迟期时间长短。氧化曲线可以分为三个阶段：a 延滞阶段：以延滞时间（min）表示，反映LDL抗氧化能力的大小。b 增殖阶段：以最大斜率表示CD最大生成率（nmolCD·mgLDL-1·min-1）。C降解阶段：生成的总CD值（nmolCD/mgLDL）表示，反映LDL氧化程度。

　　3.对照组与疾患组LDL氧化修饰延滞期比较

　　急性心肌梗死组、不稳定性心绞痛组和稳定性心绞痛组，三种不同类型病人延滞时间明显比对照组缩短（P均＜0.01），其LDL较对照组易于氧化，见表1。表1 健康与疾患组LDL 氧化修饰延滞期比较(略)注：各疾患组与对照组比较，P均＜0.01。

　　4.本法的重复性

　　由于血清用量较大，同一份标本反应重复三次，共测5份标本，分别来自各疾患组及健康组标本，记录延迟时间并观察氧化曲线特征。结果批内的延迟时间变异5.6%，曲线特征基本一致。将5份标本分别各分装成5份，-40 C冷存。每天取出一份测量，连续五天，结果批间的延迟时间变异9.5%，曲线特征基本一致。

　　5.CD法的延迟时间（min）与ELISA法测定OXLDL的比较

　　经用两种方法平行检测各疾患组每组5例（共20例）及对照组20例，并进行直线相关分析，分析结果r=0.13，P＞0.05 表明两者间尚缺乏显著相关性。

　　讨论

　　近年来的基础研究表明，氧化修饰的脂蛋白与动脉粥样硬化性心脑血管疾病的发生发展有着非常密切的关系。低密度脂蛋白经过氧化修饰后致动脉粥样硬化作用增强，因为氧化型低密度脂蛋白既可以被巨噬细胞清道夫受体吞噬形成动脉粥样硬化的早期病变——泡沫细胞，又可以刺激血管平滑肌细胞增殖及向内膜迁移，并激活血小板致血栓形成［5］。因此，氧化型LDL可能参与动脉粥样硬化发生发展的全过程。本研究采用Cu2+诱导LDL氧化修饰的，LDL修饰过程中其变化不是连续性增加，可观察到延迟期、增殖期和降解期等存在。对LDL氧化过程进行连续监控并可测出LDL氧化修饰的抑制作用，主要通过比较延迟期时间长短来进行。本研究结果表明，急性心肌梗死患者、不稳定心绞痛患者和稳定性心绞痛患者的延滞期均比正常人显著缩短（P均＜0.01），说明疾患组LDL抗氧化能力远远低于正常人，其LDL氧化易感性增强，易于促进AS的发展。其中急性心肌梗死组患者表现得最明显。共轭双烯检测法是国际公认的可靠方法，用此法与国产的ELISA法检测OxLDL的结果之间没有相关性。推测该法分离LDL在体外氧化后用于制备单克隆或多克隆抗体，由于抗原位点未完全转变为OXLDL，故其检测结果可能是多种成分的混合物，故国内在选用Ox-LDL测定方法及其临床解释方面应予以注意。

参考文献

1］Esterbauer H，Striegl G，Pugl H，et al.Continuous monitoring of in vitro oxidation of human low-density lipoproteins［J］.Free Radical Res Commun，1989，6(11):67.

　　［2］郭刚.低密度脂蛋白分离提纯和鉴定［J］.天津医学院学报，1991，15(1):16-19.

　　［3］Lowry OH，Rosebroug N，Farr AL，et al.Protein measurement with Folin phenol regent［J］.J Biol Chen，1957，193(2):265-275.

　　［4］汪俊军.低密度脂蛋白亚组分氧化易感性的检测及临床应用［J］.临床检验杂志，1999，17(2):77.

　　［5］廖郎，姑娜，田刚，等.氧化低密度脂蛋白测定及临床意义的研究［J］.检验医学与临床，2008，5(20):10-12.