作者：李宁，徐漫欢，林巍，杨汉文，王小同
【摘要】 目的 ：观察慢性低O2高CO2大鼠的学习记忆改变及施普善的干预作用。方法：通过八臂迷宫训练筛选的SD大鼠，随机分为对照组（n=8）、慢性低O2高CO2组（n=8）、慢性低O2高CO2+施普善1 mL/kg组（简称施普善1 mL/kg组，n=8）和慢性低O2高CO2+施普善2.5 mL/kg组（简称施普善2.5 mL/kg组，n=8）。将慢性低O2高CO2组及施普善干预组(1 mL/kg、2.5 mL/kg)大鼠放置于低O2高CO2密闭氧舱饲养4周，每天8 h，每周6 d。施普善干预组每天进氧舱前按既定剂量腹腔注射，慢性低O2高CO2组注射生理盐水。以八臂迷宫和Morris水迷宫实验测定其空间学习记忆功能。结果 ：与正常对照组相比， 慢性低O2高CO2组的工作记忆错误(WME)为(1.31±1.19)次，明显高于正常对照组（0.56±0.50）次（P＜0.05)，而施普善1 mL/kg组和2.5 mL/kg干预组WME均较慢性低O2高CO2模型组明显减少（P＜0.05)。Morris水迷宫，定位航行测试显示，慢性低O2高CO2模型组第3、第4、第5天的逃避潜伏期均较对照组明显延长（P＜0.05)，施普善1 mL/kg组与慢性低O2高CO2组相比，第4、第5天的逃避潜伏期明显缩短（P＜0.05)，施普善2.5 mL/kg组与慢性低O2高CO2组相比，第3、第4、第5天的逃避潜伏期明显缩短（P＜0.05)。空间搜索测试结果显示，慢性低O2高CO2组的平台穿越次数明显少于正常对照组及施普善干预组。结论：慢性低O2高CO2大鼠空间学习记忆受损，短时记忆受损明显，施普善干预可以改善慢性低O2高CO2大鼠模型的空间学习记忆能力。
【关键词】 低氧 高碳酸血症 慢性 空间学习记忆 八臂迷宫 水迷宫 施普善 大鼠
Abstract: Objective: To investigate rats’spatial learning memory damage induced by chronic hypoxia-hypercapnia and to boserve the protective effects of Cerebrolysin. Methods：Thirty-two of Sprague Dawley rats passed eight-arm radial maze task were intermittently placed in a special closed cabin for 8 h per day and lasting 4 weeks， in which there were O2 9%～11% and CO2 5%～6%. Cerebrolysin of 1 ml/kg or 2.5 ml/kg was injected intraperitoneally into the rat separately. Ethology tests were evaluated by eight-arm radial maze task and Morris water maze task. Results ：The rats exposured to chronic hypoxia-hypercapnia showed spatial learning memory damage. At eight-arm radial maze task， working memory errors (WME) in chronic hypoxia-hypercapnia group (1.31±1.19) were increased more than that in the control group. Compared with that in chronic hypoxia-hypercapnia group，working memory errors were obviously reduced （P＜0.05) in both Cerebrolysin intervention groups. At Morris water maze task， average escape latency of rat in the chronic hypoxia-hypercapnia group was more longer during the third day to the fifth day than that in the control group （P＜0.05). Cerebrolysin could more shorten rats’average escape latency than that in the chronic hypoxia-hypercapnia group（P＜0.05). In the probe test，the numbers crossing the former platform in the chronic hypoxia-hypercapnia group were significantly less than those in both control group and cerebrolysin groups. Conclusion： Rats have spatial learning memory disorders， especially remarkable loss of short-term spatial memory，induced by chronical chronic hypoxia-hypercapnia. Cerebrolysin intervention may improve the rats’spatial learning memory in chronic hypoxia-hypercapnia model to some extent.
Key words: hypoxia；hypercapnia；chronic；spatial learning memory；eight-arm radial maze task；morris water maze；Cerebrolysin；rat
慢性阻塞性肺疾病（COPD）是呼吸系统常见病、多发病，严重威胁我国人民的身体健康[1]。WHO预测2020年COPD将位居世界疾病经济负担第五位。在我国北方地区，COPD的发病率为3%。COPD是多因素诱发的疾病，低O2高CO2是COPD重要的病理生理表现。肺性脑病是以神经系统障碍为主要表现的临床综合征，常在COPD急性加重期发生，伴有呼吸困难、低氧及CO2潴留，是肺心病的重要并发症和死亡原因之一。然而，慢性病程中低O2高CO2导致的脑功能损害[2]却未引起临床医生足够的重视。
施普善（Cerebrolysin）是一种不含蛋白质的游离氨基酸及小分子多肽的混合液，游离的氨基酸和小分子多肽物质能够顺利通过血脑屏障，调节脑组织的代谢，提高脑组织抗低氧和缺血能力。本实验的研究目的是观察不同剂量的施普善对慢性低O2高CO2大鼠模型空间学习记忆的影响。
1 材料和方法
1.1 实验动物及分组 雄性SD大鼠（由温州医学院实验动物中心提供）体重280～310 g，44只，6～8个月龄，经八臂迷宫训练后淘汰12只。将32只大鼠遵循随机原则分为4组：①空白对照组8只；②慢性低O2高CO2组8只；③慢性低O2高CO2+施普善1 mL/kg组（简称施普善1 mL/kg组）8只；④慢性低O2高CO2+施普善2.5 mL/kg组（简称施普善2.5 mL/kg组）8只。
1.2 实验材料设备 施普善由奥地利依比威制药有限公司生产（批号608260），常压动物饲养低O2高CO2舱由温州医学院肺心病教研室研制并提供使用，医用压缩二氧化碳(浓度＞99.5%)和压缩高纯度氮气(浓度＞99.99% )由温州市医用氧厂提供，八臂迷宫由温州医学院神经药物研究所提供。另有八臂迷宫用饲饵(浙江大学医学院药学院)，Medlab生物信号采集处理系统(南京美易科技有限公司)，Morris 水迷宫及视频分析软件(上海吉量生物软件有限公司)。
1.3 模型的建立 训练成功的4组大鼠除空白对照组外，其余各组大鼠置于常压低O2高CO2动物饲养舱[3]内适应性饲养3 d后，每天8 h暴露在低O2高CO2环境中，以普通饲料、普通饮水饲养。施普善干预组在入舱前30 min按设定剂量给予腹腔注射施普善。氧舱内条件：吸入O2浓度为9%～11%，CO2浓度为5%～6%，温度为23～26 ℃，湿度为50%～70%。动物自由摄食摄水，其余时间于正常环境中饲养，每周6 d，连续4周。
1.4 行为学测试
1.4.1 八臂迷宫实验：参照Zou等[4]的方法进行训练。测定自由摄食状体下大鼠的体重，于训练前将大鼠禁食1 d，其后限食1 d，使其体重降至原来体重的85%左右，在整个训练期间限食并维持原来体重的85%左右不变。大鼠在迷宫中预适应2 d，每天1次，第1天在八个臂中均撒上饵片任其自由摄食饵片10 min，第2天在固定的四臂中放置饵片（1、2、4、7臂），任其在迷宫中寻找食物10 min。训练时，在选定的1、2、4、7臂中放置饵片，该次序维持到训练结束不变，将大鼠放于迷宫中央区，用小桶盖住，在迷宫中适应15 s后提起小桶放出大鼠，大鼠可以自由选择任意一臂摄取饵片。大鼠进入有饵片的臂并摄取了饵片为一次正确的选择不做记录，再次进入放饵片的臂称为工作记忆错误（working memory error，WME），进入不放饵片的臂称为参考记忆错误（reference memory error，RME），两者之和为总的记忆错误（total memory error，TE）。训练成功的标准：连续5次训练总错误次数≤1次，同时WME为零。记录参数为WME、RME及TE。
1.4.2 Morris水迷宫实验：参照Morris[5]和王蓉等[6]的方法，将经氧舱饲养到相应时间的4组大鼠进行水迷宫实验。第1天预适应，在实验过程中保持光线、水温、周边参照物的恒定。
定位航行实验：连续进行5 d，每天1次，分别从四个象限将大鼠头朝池壁入水，自动摄像系统和计算机分析处理系统记录每只动物的逃避潜伏期(逃避潜伏期是指大鼠从不同象限入水找到平台的总时间)和游泳距离(游泳距离是指大鼠从不同象限入水找到平台时的游泳总距离)等指标。若120 s后仍不能找到平台，则以120 s计算，并结束本次实验，在第1、第2天将其引导至平台停留10 s，以后第3天起不再引导。
空间搜索实验：第6天进行平台搜索实验，撤去平台，任选一个象限入水，其后4组大鼠均固定该象限入水，记录并观察120 s内大鼠穿越平台的次数。
1.6 统计学处理方法 采用单因素方差分析和重复测量的多因素方差分析。
2 结果
2.1 八壁迷宫测试结果 与对照组相比，慢性低O2高CO2组的WME明显增加（P＜0.05），而RME差异无显著性（P＞0.05）。与慢性低O2高CO2组比较，施普善1 mL/kg和2.5 mL/kg干预组的WME、TE均减少（P＜0.05），RME差异无显著性(P＞0.05)。施普善两组之间的TE，RME，WME差异无显著性（P &>0.05）（见表1）。
2.2 Morris水迷宫的实验结果 定位航行部分：慢性低O2高CO2组训练后第3、第4、第5天的平均逃避潜伏期较正常对照组长(P &<0.05)；1 mL/kg施普善干预组的第4、第5天的逃避潜伏期较慢性低O2高CO2组短(P &<0.05)，而2.5 mL/kg施普善干预组第3、第4、第5天的平均逃避潜伏期较慢性低O2高CO2组短（P &<0.05)(见表2)。
空间搜索部分：第六日撤去平台后，慢性低O2高CO2组穿越平台的次数较正常对照组相比明显减少（P &<0.05)，不同剂量施普善干预组穿越平台的次数都较慢性低O2高CO2组多（P &<0.05)(见表3)。
3 讨论
COPD患者不仅存在肺内病变，还存在肺外病变[7]，其所致的认知功能障碍逐步得到证实[8-9]。COPD所致的认知功能障碍的机制尚未完全阐明，目前认为主要与高碳酸血症和呼吸受限所引起的低氧有关，对低氧敏感的海马和边缘系统容易受损，同时伴有的额叶、皮质下的血液灌注量下降，额叶和皮质层下结构损伤等[10-13]。认知功能障碍的严重程度与低氧程度密切相关[14]。本实验采用的慢性低O2高CO2大鼠模型，是研究COPD认知功能障碍较理想的动物模型[15]。
本研究采用八臂迷宫和Morris水迷宫实验测试大鼠认知功能。八臂迷宫的WME反映短时空间记忆， RME反映长时空间记忆。在本实验中，慢性低O2高CO2模型的大鼠WME明显增加，这与COPD患者出现的以短时记忆障碍为主要表现的记忆障碍相符合。施普善干预组的大鼠，其WME、TE的错误次数比慢性低O2高CO2模型组大鼠明显少。在Morris水迷宫实验中逃避潜伏期越短说明大鼠对平台的空间位置记忆越好，而空间探索实验通过其在水迷宫中的穿越平台的次数来反映大鼠经定位航行实验游泳训练后对平台的空间记忆能力。慢性低O2高CO2组大鼠的平均逃避潜伏期较正常组明显长，而施普善干预组的平均逃避潜伏期较慢性低O2高CO2组短，穿越平台的次数也较慢性低O2高CO2模型组多。以上行为学观察结果提示，低O2高CO2模型大鼠的空间学习记忆能力及短时记忆均明显受损，而施普善干预后，能够有效改善这两种认知功能障碍。
施普善是猪脑组织经过复合蛋白酶水解、纯化后提取，其主要成分为小分子多肽和游离氨基酸。在大量动物和临床试验中，施普善具有神经营养和神经保护的作用，其机制可能与施普善的成分有关：小分子多肽和游离氨基酸能够顺利地通过血脑屏障而进入脑细胞中，调节脑细胞的能量代谢、蛋白质的合成，参与呼吸链的能量传递及神经递质的合成等[16-17]。施普善能够诱导老龄大鼠海马内神经干细胞的分化，并促进神经突触的形成[18]。对脊髓腹侧撕脱伤神经移植的大鼠进行研究发现，鞘内注射施普善，不仅可挽救受损的运动神经元，促进其轴索的再生，还可促进再生轴索的成熟，从而发挥神经生长因子作用，维持神经细胞的存活[19]。本实验发现施普善能够改善慢性低O2高CO2大鼠空间记忆障碍和短时记忆功能障碍，但其具体机制还有待进一步的研究。
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