【摘要】 目的 ：探讨喉鳞状细胞癌中PTEN和增殖细胞核抗原（proliferating ceu nuclear antigen，PCNA）的表达及其临床意义。方法 ：应用免疫组化SP法检测40例喉鳞癌中PTEN和PCNA的表达，并取30例声带息肉作对照。结果 ：PTEN在喉鳞癌中阳性表达率为52.5%，低于对照组的93.3%(P &<0.05)。PTEN在喉鳞癌中的表达与病理分级、临床分期及淋巴结转移有关（均P &<0.05），与年龄、原发部位无显著相关(P &>0.05)。PCNA在喉鳞癌中的表达率为77.5%，在声带息肉中为16.7%，两者间比较差异有显著性(P &<0.05)。PCNA的表达强度与喉癌的病理分级、临床分期及淋巴结转移呈显著相关，与年龄、原发部位无关。PTEN和PCNA的表达具有相关性(P &<0.05)。结论 ：PTEN表达的下调和PCNA的过表达在喉鳞癌的发生、发展及转移过程中发挥重要作用，二者对于判断喉癌的进展和预后具有重要的临床意义。
【关键词】 喉肿瘤 癌 鳞状细胞 PTEN 增殖细胞核抗原 免疫组织化学
Abstract: Objective: To explore the expression and significance of PTEN and PCNA in laryngeal squemous cell Carcinoma (LSCC). Methods: The expression of PTEN and PCNA in 40 cases of laryngeal squemous cell Carcinoma (LSCC) was detected with immunohistochemical method (SP)、Thirty cases of polyp of vocal cord were used as control. Results: The positive expression rate of PTEN in LSCC was 52.5%. The expression of PTEN was significantly lower in Lscc compared to normal controls. The expression of PTEN in LSCC was related to pathological stages，clinical stage and metastasis of lymph node (P &<0.05)， but was not associated with age， and hypopharyngeal. (P &>0.05). The positive rate of PCNA was 77.5% and 16.7% in LSCC and polyp of vocal cord， respectively， and the intensity of positive expression of PCNA was significally related to the histological grade，clinical stage and metastasis of lymph node(P &<0.05)， but was not associated with age， and tumor site. PTEN activity was associated with PCNA expression in LSCC (P &<0.05). Conclusion: Decreased expression of PTEN found in LSCC，may be correlated with the development and metastasis of LSCC，and reversely correlated with the expression of PCNA: Combined detection of PTEN and PCNA may be helpful to evaluate the progress and prognosis of LSCC.
Key words: laryngeal neoplasms；carcinoma，squamous cell；PTEN；proliferating cell nuclear antigen；immunohistochemical
喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤，且发病率呈逐年上升趋势。通过对肿瘤的深入研究，人们发现肿瘤也是一种基因异常变化的疾病，有多种癌基因及抑癌基因参与发病。PTEN基因是一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，其基因的突变或丢失必然引起编码蛋白异常表达。增殖细胞核抗原（Proliferating ceu nuclear antigen，PCNA）是一种与细胞周期相关的蛋白，参与细胞DNA复制，其表达水平与肿瘤细胞增殖有关。近年来有学者发现，PTEN和PCNA蛋白与许多肿瘤中的发生、发展有关，但与喉鳞状细胞癌的关系研究较少文献报道。本研究应用免疫组化方法，对喉癌中PTEN和PCNA的表达水平进行分析，旨在探讨两者之间及其与喉癌临床特点的关系。
1 材料和方法
1.1 材料 收集2002-2004年温州市第三人民医院及温州医学院附属第一医院手术治疗的喉癌患者病倒40例，术后经病理证实为鳞状细胞癌，术前均未进行放疗和化疗。40例中，男31例，女9例，年龄40～80岁，平均年龄59.56岁。根据2002年AJCC的分期标准：TNM I期12例，II期11例，III期10例，IV期7例。其中高分化10例，中分化19例，低分化11例。术后证实无淋巴结转移25例，有淋巴结转移15例。另外选取30例声带息肉作为对照组。
1.2 方法 所有标本均经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，3μm厚连续切片。参考说明书操作：石蜡切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，高压抗原修复，3%过氧化氢阻断后，分别加入鼠抗人PTEN单抗、鼠抗人PCNA单抗，4 ℃过夜后，加二抗，DAB显色，苏木精复染，常规脱水，中性树脂封片。以已知阳性片为阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。鼠抗人PTEN单克隆抗体、鼠抗人PCNA单克隆抗体、SP试剂盒及DAB底物显色剂购自北京中杉金桥生物有限公司。
1.3 结果判断 PTEN蛋白和PCNA表达产物均主要定位于细胞核。每张切片随机选取5个高倍视野，由同一位医师用显微镜进行细胞计数。按染色强度及阳性细胞数所占百分比综合计分。染色强度：无色计为0分，淡黄色计为1分，棕黄色计为2分，棕褐色为3分；阳性细胞数：&<5%时计为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，&>50%为3分。染色强度得分与阳性细胞数得分相加，0分计为（-），1～3分计为弱阳性（+），4～5分计为中度阳性（++），6分计为强阳性（+++）。
1.4 统计学处理方法 采用x2检验，并作Pearson相关分析。
2 结果
2.1 PTEN在喉癌中的表达 PTEN蛋白表达产物定位于细胞核，呈棕黄色或棕褐色均匀颗粒(见图1)。PTEN在喉鳞癌组织中阳性表达率为52.5%（21/40），对照组为93.3%（28/30），差异有显著性（x2=13.611，P &<0.05）。喉鳞癌中PTEN的表达与病理分级、临床分期及淋巴结转移之间有相关（均P&<0.05），而与患者年龄、临床分型无关（P &>0.05），见表1。
2.2PCNA在喉癌的表达 PCNA阳性表达产物定位于细胞核，呈棕黄色或棕褐色颗粒(见图2)。在40例喉鳞癌中， PCNA阳性表达率为77.5%（31/40），在声带息肉中阳性表达率为16.7%（5/30），两者差异有显著性（P &<0.05）。PCNA的表达强度与喉鳞癌的临床分期、病理分级及淋巴结转移有关（均P&<0.05），但与患者年龄、临床分型无显著相关（P &>0.05），见表1。
2.3 PTEN与PCNA表达的相互关系 在喉鳞癌组织中PTEN表达与PCNA表达，应用x2检验，P &<0.05，差异有显著性，Pearson列联系数r=0.45，说明两者之间存在相关性；并从统计数据来看，在PTEN低表达组往往有PCNA的高表达，19例PTEN低表达组中，PCNA高表达的有18例（占95%），说明两者之间存在负相关，见表2。
3 讨论
近年来研究表明，几乎所有肿瘤都存在一种以上的与细胞周期调控相关的基因发生突变，细胞周期调控异常与肿瘤的发生密切相关。侵袭和转移是恶性肿瘤的重要特性，是影响预后的重要因素，寻找有价值的预测预后及指导临床治疗的生物学指标已成为肿瘤研究的新热点。PTEN基因（也称MMAC1或TEP1）是1997年克隆到的第一个具有磷酸酶活性的抑制基因[1]，它定位于10q23，在许多肿瘤中这个基因区域有杂合性丢失。PTEN具有脂质磷酸酶活性，使磷脂酰肌醇（3，4，5）-三磷酸（PIP3）去磷酸化，负性调节PI3K途径，使细胞凋亡和（或）抑制细胞周期进程，并诱导其在G1期终止，从而抑制细胞生长繁殖[2]。PTEN还具有蛋白磷酸酶活性，可抑制有丝分裂原激活蛋白激酶（MAPK）途径。MAPK具有酪氨酸蛋白激酶活性，PTEN通过拮抗促生长的蛋白酪氨酸激酶而抑制肿瘤的生长和繁殖[3]。PTEN还能使聚集黏连激酶（FAK）去磷酸化，抑制其活性，负性调节细胞的黏连、转移和浸润[4-5]。可见PTEN基因在肿瘤中发生突变或丢失后，肿瘤细胞的负调控作用受到抑制，促进细胞生长、浸润、转移。大量研究证明，PTEN蛋白在多种肿瘤中表达下调，且表达的水平与肿瘤的恶性程度呈负相关，说明PTEN与多种恶性肿瘤如：胃癌、宫颈癌、间皮瘤等的发生、发展密切相关[6-7]。我们研究发现PTEN在正常组织中表达率为93.3%，喉癌中表达率为52.5%，提示PTEN表达下调与喉鳞癌的发生有关。其中高分化组为80%，中～低分化组为43.3%，随着病变程度的加重呈递减趋势，也提示了该基因在诱导肿瘤分化过程中起重要作用。另外，PTEN的表达与临床分期、淋巴结转移显著相关（均P&<0.05），提示随着肿瘤的发展、转移，PTEN蛋白表达下降与喉鳞癌进展有关。因此PTEN蛋白的检测不仅有助于了解喉鳞癌发生、发展的分子生物学机制，而且对判断患者的预后等可提供参考价值，为临床治疗等提供新的方向。
PCNA是一种细胞周期调控蛋白，相对分子量为（33～36）×103，为δ-DNA聚合酶的辅蛋白，是DNA复制及增殖所必需的。在静止期细胞中PCNA含量很少，G1期开始增加，S期达高峰，G2和M期明显下降，因此其合成表达与细胞增殖有明显关系。大多文献报道PCNA的异常表达与肿瘤分期、疗效、预后有密切关系[8-9]。本研究发现，喉癌组织中PCNA的表达率为77.5%，而正常组织中为16.7%，两者之间差异有显著性（P &<0.05），PCNA的高表达可能参与喉癌的发生。随着病理分级的升高，PCNA的表达有所上升，与Kayaseluck等[10]的研究结论相似。我们认为病理分级差的肿瘤，其细胞形态幼稚，细胞分裂能力强，因而作为细胞增殖活性指标的PCNA含量较分化良好的肿瘤高。另外研究结果表明PCNA蛋白在TNM分期III～IV期、有颈淋巴结转移患者中的表达水平明显高于I～II期及无淋巴结转移患者，说明PCNA不仅与喉癌的病理分级有关，而且与患者的预后及颈淋巴结转移有关。故检测PCNA可作为判断喉癌恶性程度及估计患者预后的指标，指导临床治疗。
有研究报道PTEN能特异性地诱导3个周期素依赖性激酶（CDK）抑制剂：P21、P27、CDK3、CDK4、CDK6，还与DNA聚合酶竞争结合增殖细胞核抗原，使DNA复制受阻，停滞于G1晚期，PTEN的缺失导致细胞增殖加速，作为细胞增殖活性指标的PCNA表达增加[11]。本实验结果显示，PTEN蛋白下调，PCNA增强，二者呈负相关，提示PTEN表达下降促进了肿瘤细胞增殖活性的增强，两者可能协同促进了喉鳞癌的发生、发展，联合检测PTEN和PCNA可作为早期诊断喉鳞状细胞癌的一项客观指标，对喉鳞癌的预后判断具有重要意义。
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