作者：吴立琴，戴元荣，夏晓东
【摘要】 目的 ：观察哮喘大鼠肺组织中p-Akt、p-p70S6K含量变化，探讨磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信号转导途径在哮喘大鼠气道平滑肌细胞（ASMC）增殖中的作用。方法 ：SPF级健康雄性SD大鼠36只，随机分为对照组（C组）、哮喘组（A组）和wortmannin干预组（W组），每组12只。以卵蛋白（OVA）致敏和激发的方法制备大鼠慢性哮喘模型。观察各组大鼠气道炎症和细胞浸润情况；以图像分析软件测定气道壁厚度（Wat）及气道平滑肌层厚度（Wam）；以Western blot法检测肺组织p-Akt及p-p70S6K表达情况。结果：①A组大鼠Wat、Wam大于C组（P &<0.01）；W组大鼠Wat、Wam小于A组（P &<0.01），大于C组（P &<0.01）。②A组p-Akt及p-p70S6K含量均高于C组（P &<0.01）；W组低于A组（P &<0.01），但高于C组（P &<0.01）。③p-Akt蛋白含量与Wam/Pbm呈显著正相关(r =0.779，P &<0.01) ；p-Akt蛋白含量与p-p70S6K蛋白含量呈显著正相关(r =0.803，P &<0.01)。结论 ：哮喘大鼠肺组织中PI3K/Akt/p70S6K途径激活，抑制该途径可减轻哮喘大鼠ASMC增殖。
【关键词】 哮喘 大鼠 气道重塑 信号转导 平滑肌细胞
Abstract: Objective: To observe the changes of p-Akt，p-p70S6K in lung tissues of asthma rat and to evaluate the role of phosphoinositide 3-kinase signal pathway in ASMCs proliferation in asthma. Methods: Thirty-six male Sprague-Dawley rats were randomly pided into three groups on average， including control group (group C)，asthma group (group A) and wortmannin treated group (group W). In this experiment the rat model of chronic asthma was exploited， in which rats were sensitized with ovalbumin and Al (OH) 3，and repeatedly exposed to aerosolized ovalbumin. Airway remodeling was obtained by measurement and calculation of Wat and Wam under microscope. p-Akt protein and p-p70S6K protein in rat lung tissues were measured by western-blot. Results: ①Wat and Wam in group A were significantly increased than that of group C (P &<0.01）；Wat and Wam in group W was decreased than that of group A (P &<0.01)， but still higher than that of group C (P &<0.01). ②The level of p-Akt and p-p70S6K protein in group A were both significantly higher than that of group C (P &<0.01). And the level of p-Akt and p-p70S6K protein in group W were lower than that of group A (P &<0.01)， but still higher than that of group C (P &<0.01). ③There was a significant positive correlation between p-Akt and Wam/Pbm. There was a significant positive correlation between p-Akt and p-p70S6K. Conclusion: The expression of p-Akt and p-p70S6K increased in lung tissues of asthmatic rat model and wortmannin can reduce ASMCs proliferation， which implicates that PI3K signal transduction pathway plays an important role in the ASMCs proliferation of asthma.
Key words: asthma；rat；airway remodeling；signal transduction；smooth muscle cell
哮喘患者的气道重塑主要包括气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells，ASMC)增生/肥大、基底膜增厚、血管生成等，其中最明显的是ASMC的增生和肥大[1]。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）在ASMC增殖中的作用最近有初步阐明，但其是否介导哮喘ASMC增殖尚不明确。我们通过复制大鼠慢性哮喘模型，研究PI3K的下游信号分子Akt、p70S6K活性变化，并予PI3K特异性抑制剂wortmannin干预，探讨PI3K信号途径在哮喘ASMC增殖中的作用。
1 材料和方法
1.1 实验动物 SPF级健康雄性Sprague-Dawlay（SD）大鼠36只，6～8周龄，体重（200±10）g，由温州医学院实验动物中心提供。饲养温度25 ℃，相对湿度70%，昼夜照明12/12 h。
1.2 主要试剂及药品 卵白蛋白（OVA）为Sigma公司产品，wotmannin为Biomol公司产品，兔抗大鼠磷酸化Akt多克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗均为美国CST产品，兔抗大鼠p70S6K多克隆抗体、兔抗大鼠磷酸化p70S6K多克隆抗体及兔抗大鼠β-actin多克隆抗体均为Santa Cruz产品。
1.3 哮喘大鼠气道重塑模型复制 SPF级雄性健康SD大鼠36只，随机分为3组（n=12），分别为：正常对照组（C组）、哮喘组（A组）以及wortmannin（W组）。大鼠哮喘模型参照文献[2-3]方法建立并稍加改进：第1天腹腔内注射10%的OVA和10%的氢氧化铝混合液1 mL，第8天以相同剂量、相同方法加强致敏1次；致敏后第15天开始予1%OVA雾化吸入刺激，每周3次，每次30 min，连续8周。C组则代以生理盐水致敏和激发大鼠；W组致敏阶段同哮喘组，激发阶段在每次激发前半小时腹腔注射wortmannin (15μg/kg)。
1.4 肺组织显微结构观察及支气管壁厚度和支气管平滑肌厚度测定 肺组织进行石蜡包埋切片及HE染色，光镜下观察支气管及血管周围的炎性细胞浸润情况、支气管上皮损伤情况和支气管平滑肌层是否增厚等情况。应用Image-Pro plus 6.0医学图像分析软件，在200倍光镜下，每只大鼠挑选3支有完整横断面的中小支气管，参照文献[4]关于气道各层定义寻找标志，测量支气管基底膜周径(Pbm)、支气管总面积（Wat1）、管腔面积（Wat2）、平滑肌外缘内气管面积（Wam1）、平滑肌内缘内气管面积（Wam2）。计算标准化总管壁厚度（Wat）为（Wat1璚at2）/Pbm，标准化平滑肌厚度（Wam）为（Wam1璚am2）/Pbm[5]。最后计算3个Pbm、Wat、Wam数据平均值作为该标本代表值。
1.5 Western blot法测定肺组织p-Akt及p-p70S6K 提取细胞总蛋白质，以BCA法进行蛋白定量。按每孔100μg蛋白量加样进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离的蛋白转膜至PVDF膜，以5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别加兔抗大鼠p瑼kt多克隆抗体(1:1 000)或兔抗大鼠β-actin抗体(1:1 000)，于4 ℃过夜。以三羟甲基氨基甲烷缓冲液（TBS）洗膜后加辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗（1:2 000），于室温孵育1 h，洗膜，用ECL显影。用Quantity One凝胶软件分析系统分析p-Akt蛋白和内参β-actin光密度值，以目的蛋白p-Akt条带光密度和内参β-actin光密度比值代表p-Akt的光密度值。Western Blot检测p-p70S6K蛋白时，一抗孵育分别予兔抗大鼠p70S6K及p-p70S6K多克隆抗体，以p-p70S6K条带光密度和p70S6K光密度比值代表p-p70S6K的光密度值，其余步骤均同p-Akt。
1.6 统计学处理方法 组间比较采用单因素方差分析，进行方差齐性检验，方差齐者用LSD，方差不齐者用Dunnet’s T3法检验。两变量的相关程度用直线相关分析法分析。
2 结果
2.1 肺组织显微结构改变 光镜下可见C组大鼠支气管上皮完整，无明显炎症反应，肺组织形态正常；A组大鼠支气管上皮脱落，支气管壁和血管壁周围有大量炎性细胞浸润，以嗜酸性粒细胞和淋巴细胞为主，平滑肌层明显增厚，管腔狭窄；W组炎症反应较轻，气道壁各层（尤其是平滑肌层）厚度较A组明显降低（见图1）。
2.2 支气管壁厚度、平滑肌层厚度比较 各组大鼠支气管基底膜周径(Pbm)比较差异无显著性（P >0.05），说明所测量的支气管平均大小相似，各组支气管壁厚度（Wat）、平滑肌层厚度（Wam）具有可比性。各组大鼠支气管壁厚度、平滑肌层厚度测定结果见表1。
2.3 各组大鼠肺组织p-Akt蛋白和p-p70S6k蛋白表达情况 A组大鼠肺组织p-Akt表达量较C组升高，W组p-Akt蛋白表达量较A组降低，但仍高于C组（见表2、图2）。A组大鼠p-p70S6K表达量较C组升高，W组p-p70S6K蛋白表达量较A组降低，但仍高于C组（见表2、图3）。
2.4 相关性分析 Wam/Pbm与p-Akt蛋白含量呈显著正相关(r =0.779，P <0.01，n =18)；p-Akt蛋白含量与p-p70S6K蛋白含量呈显著正相关(r =0.803，P <0.01，n =18)。
3 讨论
气道重塑是慢性哮喘的重要特征，ASMC增殖在哮喘气道重塑中发挥了重要作用。研究发现哮喘患者气道平滑肌层明显增厚，致死性和非致死性哮喘患者气道平滑肌面积分别增加50%～230%和25%～150%[6]。本实验观察到哮喘组大鼠气管壁及支气管平滑肌层增厚，且测量的平滑肌厚度较对照组显著增加，表明在大鼠哮喘气道重塑模型ASMC增殖明显，与以往的报道相一致[7]。
ERK和PI3K的激活可能是介导生长因子、炎症递质和和细胞因子诱导ASMC增殖的两条主要信号转导途径。Scott等[8]首先发现，PI3K的活性与牛气道平滑肌细胞的丝裂原刺激反应有关，PI3K抑制剂wortmannin可以减少DNA的合成。Krymskaya 等[9]通过显微注射的方法把活化的PI3K导入ASMC 内，结果证明活化的PI3K能单独刺激ASMC DNA的合成。因此PI3K调节DNA合成并不依赖ERK，而是一条与之平行的途径。PI3K是细胞内重要的信号转导分子，共分为三型，其中Ⅰ型中的IA类是由p110（α，-β或-δ）和p85α或p85β或p55γ组成的异源二聚体，广泛表达于哺乳动物的肺、心、脑组织中，主要为受体或非受体型酪氨酸蛋白激酶激活。PI3K活化后可催化磷脂酰肌醇在D3位的磷酸化，把底物PtdIns(4，5)P2转化为PtdIns(3，4，5)P3，作为第二信使激活下游信号分子如Akt、p70S6K调解细胞周期蛋白表达，进而磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白（Rb），促进DNA的合成，推进细胞增殖周期的进展，从而调节ASMC的增殖[10]。
慢性哮喘患者中均存在ASMC的过度增殖，目前关于介导哮喘ASMC增殖的机制尚不明确。刘瑾等[11]发现哮喘组大鼠ASMCs胞浆内PI3K蛋白表达量明显高于正常对照组；莫碧文等[12]发现哮喘组大鼠支气管平滑肌内PI3K mRNA含量明显高于对照组，但他们均未进一步检测PI3K下游信号分子如Akt、p70S6K。本实验检测了各组大鼠肺组织中p-Akt（Ser473）及p-p70S6K（Thr389）蛋白含量，结果显示哮喘组大鼠肺组织中p-Akt及p-p70S6K蛋白含量高于对照组，wortmannin干预组含量低于哮喘组，但高于对照组。相关分析示大鼠Wam/Pbm与p-Akt含量呈显著正相关，p-Akt与p-p70S6K表达呈显著正相关，表明PI3K通过激活下游信号分子Akt及p70S6K从而促进哮喘大鼠ASMC增殖，经PI3K特异性抑制剂wortmannin干预后能阻断该途径，进而抑制ASMC增殖。
参考文献
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