作者：黄勋福，房惠琼，谭光明，李启明，韩福兰，毛荣军，吴燕杏
【摘要】 目的 通过一次性标记的方法，探讨混合型抗体P504s/P63/34βE12在前列腺癌穿刺标本中的诊断价值。方法 选择前列腺穿刺标本50例，包括前列腺癌40例，良性前列腺增生10例。同时采用双酶标记法检测混合型抗体P504s/P63/34βE12及单酶标记法分别检测单标抗体P504s、P63及34βE12，观察两种方法的标记结果。结果 在40例前列腺癌中，用P504s/P63/34βE12双酶标记法有37例（92.50%）P504s阳性表达，P63、34βE12全部阴性表达；用单酶标记法有36例（90%）P504s阳性表达，P63、34βE12全部阴性表达；10例良性前列腺增生中，两种方法结果完全一致，P504s全部病例阴性表达，P63、34βE12全部病例阳性表达。两种方法在前列腺穿刺标本中表达的一致率为98%。结论 通过对两种染色方法的比较，混合型抗体P504s/P63/34βE12双酶标记法较单标抗体单酶标记法更易于观察分辨，尤其对前列腺穿刺标本，前列腺癌的检出率更高，但差异无显著性。
【关键词】 前列腺肿瘤；P504s；34βE12；P63；生物学标记
Abstract: Objective To assess the value of P504s/P63/34βE12 cocktail in diagnosis of prostate carcinoma by one-time staining. Methods Prostate puncture biopsy specimens from 50 patients were selected， including 40 cases of prostate cancer and 10 cases of benign prostatic hypertrophy (BPH). Each of three monoclonal antibodies and cocktail antibodies were used to measure p504s， p63， 34βE12 in different prostate lesions， respectively. The staining results were recorded. Results Of 40 prostatic cancer cases， 37 cases (92.50%) stained positively with P504s and all 40 cases stained negatively with P63 and 34βE12 by cocktail-staining; 36 cases (90%) stained positively with P504s and all 40 cases stained negatively with P63 and 34βE12 by monoclonal antibody-staining. Of 10 BPH cases， the same results were obtained by the two staining techniques， all cases stained negatively with P504s， and all cases stained positively with P63 and 34βE12. The agreement rate was 98% by the two techniques in prostate puncture biopsy specimens. Conclusion Immuno-histochemical analysis with a triple-antibody cocktail (P504s/P63/34BE12) has higher sensitivity and specificity than single antibody staining， and it can improve the detection rate of small focal prostate carcinoma， but there was no statistical difference.
Key words: prostatic neoplasms; P504s; P63; 34βE12; biological markers
前列腺癌是老年人常见的恶性肿瘤之一，据报道发病率有逐年上升的趋势，美国近期发现的前列腺癌的平均直径在1cm左右［1］。随着微创技术的发展，前列腺穿刺活检在临床的应用越来越普遍，对病理技术、病理诊断的要求也越来越高；对前列腺穿刺标本中的可疑小灶病变，目前多采用P504s（α－甲酰基辅酶A消旋酶）、P63和34βE12抗体分别检测不同切片中的前列腺癌细胞和基底细胞来辅助诊断，大大提高了前列腺癌的早期检出率。最近有一种混合型抗体P504s/P63/34βE12，可以一次性标记在一张病理切片，同时检测3种抗原，更易于观察。本组通过对前列腺癌及前列腺增生的病例同时进行混合型抗体的一次性标记和单标抗体的独立检测比较，评估混合型抗体P504s/P63/34βE12的一次性标记在前列腺癌穿刺标本中的诊断价值。
1 材料与方法
1.1 标本来源 随机抽取佛山市中医院2005年6月～2007年12月前列腺癌穿刺标本40例，良性前列腺增生标本10例。所有标本均为10%福尔马林固定，石蜡包埋，并已诊断明确（根据WHO诊断标准）。每份标本连续切片五张，厚度3μm，一张采用混合型抗体P504s/P63/34βE12的一次性标记法，双酶标记显色；三张采用传统单标抗体标记法，单酶标记显色，分别标记P504s、P63、34βE12，剩下一张备用。
1.2 免疫组化染色 前列腺病变组织免疫组化双染检测试剂盒及单个抗体P504s(13H4)、P63（4A4）、CK(34βE12)均购自福州迈新生物技术开发有限公司。混合型抗体中，P504s为兔单克隆抗体，其二抗为羊抗兔的单抗，标记物为碱性磷酸酶，显色剂是NBT。P63、34βE12为鼠单克隆抗体，其二抗为羊抗鼠的单抗，标记物是辣根过氧化物酶，显色剂是AEC。单标抗体中，P504s为兔单克隆抗体，P63、34βE12为鼠单克隆抗体，二抗采用通用型二抗—HRP聚盒物（购自福州迈新生物技术开发有限公司），显色剂是DAB。操作步骤如下，切片脱蜡入水，3%双氧水浸泡10min除去内源性过氧化物酶，高压锅抗原修复（EDTA修复液加热100℃，切片入水，加阀至排气计时1min30s ），室温冷却后，双染法加正常非免疫血清室温孵育10min，然后除去血清；加一抗室温孵育60min，PBS冲洗3×3；加二抗室温孵育15min，PBS冲洗3×3；NBT显色10～20min，蒸馏水冲洗2次；AEC显色10～20min，蒸馏水冲洗3次；苏木素复染10～20s，PBS返蓝，蒸馏水冲洗干净；直接滴加水性封片剂，60℃烘干；中性树胶封片。单标法加一抗室温孵育60min，PBS冲洗3×3；加二抗室温孵育30min，PBS冲洗3×3；DAB显色，苏木素复染2min，蒸馏水返蓝，中性树胶封片。
1.3 结果观察及判定 P504s以前列腺腺上皮细胞为靶细胞，34βE12以和P63以基底细胞为靶细胞。混合型抗体免疫组化染色结果的判定：P504s以靶细胞胞质或顶端胞质内出现蓝黑色粗大颗粒状物为阳性，不见明显表达为阴性；34βE12以靶细胞胞质出现红色颗粒为阳性，P63以靶细胞胞核出现红色颗粒为阳性，反之为阴性。单标抗体免疫组化染色结果的判定：P504s和34βE12均以靶细胞胞质出现黄褐色颗粒为阳性，P63以靶细胞胞核出现黄褐色颗粒为阳性，否则判断为阴性。
2 结果
混合型抗体中40例前列腺癌有37例（92.50%）P504s阳性表达，P63、34βE12全部阴性表达；单标抗体40例前列腺癌36例（90%）P504s阳性表达，P63、34βE12全部阴性表达。其中1例混合型抗体标记P504s阳性，而单标抗体P504s阴性，主要是由于癌灶太小（直径＜1mm)，多次切片后单标P504s的切片刚好没有癌灶，而P63、34βE12切片见癌灶并显示阴性。10例良性前列腺增生的穿刺标本两种方法P504s全部阴性表达，P63、34βE12全部阳性表达。两种方法在穿刺前列腺疾病中的表达一致率为98%，见表1。两种方法的差异主要表现在染色强度和色彩对比的清晰度上，混合抗体较单标抗体表达更为直观，三种抗原结果在一张片上清晰可辨。
表1 50例前列腺穿刺标本的混合型抗体中的P504s与单标抗体P504s染色比较（略）
3 讨论
3.1 三种前列腺癌免疫组化标志物
3.1.1 P504s P504s又称α-甲基酰基辅酶A 消旋酶(α-Methylacyl-CoA racemase) 是一种细胞质内的蛋白。P504s存在于线粒体和过氧化物酶体上，参与脂肪酸和脂肪酸衍生物的β氧化。2000年Xu等［2］采用基因芯片筛选发现，P504s在前列腺癌中过表达。而后的一些研究报道进一步证实，P504s在前列腺癌中表达率是83%～100%［3～5］，在高级别PIN中表达率是71.4%～88.9%［6，7］。因此，P504S 被认为是前列腺癌和高级别PIN的高度敏感和特异的标记物。
3.1.2 34βE12和P63 细胞角蛋白34βE12和P63都是前列腺基底细胞的标记物［8，9］，以往的诊断中只是利用34βE12或P63来确定基底细胞的存在和完整性，从而间接判断标本的良、恶性。但是阴性标记物的局限性是显而易见的，因此将P504s和34βE12及P63联合使用，可据此从正、反两个方面互相印证结果，提高前列腺癌的检出率，尤其是提高前列腺穿刺标本中高分化微量前列腺癌的检出率。
3.2 三种抗体一次性标记诊断的优势 混合型抗体一次性标记法的优点最能体现在穿刺标本中小灶性的可疑病变的诊断和鉴别诊断，便于分析和对比；由于连续切片腺体的形态会有一些变化，不利于观察在同一个腺体中多种抗原的表达情况，单标法需要三张切片，有时会因为病灶小在一张切片上出现的腺体在另一张可能就消失了，以致影响抗原的标记，混合型抗体P504s/P63/34βE12双酶标记法就避免了这些问题，只需一张切片进行一次染色程序就可观察到P504s/P63/34βE12三种抗原的标记情况，一目了然。而其标记结果与传统单标法符合率高达98%，对小灶癌的检出率甚至更高，但差异无显著性（P＞0.05）。
3.3 操作注意事项 尽管混合型抗体P504s/P63/34βE12双酶标记法显示了其优越性，但在操作过程中由于P63/34βE12的显色剂AEC不稳定，容易褪色，应趁组织切片湿润未干时及时滴加水性封片剂，并烘干，否则会影响P63/34βE12的观察结果。其次，虽然混合型抗体可以一次性标记三种抗体，但二次显色耗时较单标法一次显色长。
4 小结
穿刺前列腺标本由于连续切片，有时一张切片上能观察到的细胞，在另一张切片上可能就不存在了，无法在同一个病灶中观察到几种标记抗原，给临床病理诊断带来了一定的困难，有时甚至会存在漏诊。所以我们认为对仅有几个可疑腺体的穿刺前列腺标本免疫组化标记时，最好同时做混合型抗体P504s/P63/34βE12双酶标记法和单标，可以起双保险的作用。当然前列腺癌的诊断仅靠免疫组化染色具有片面性，还应结合HE切片和临床资料综合考虑。
参考文献
［1］ 杜娟，裴斐，郑杰，等.P504s、34βE12在双重免疫组织化学染色在前列腺癌诊断中的应用［J］.中华病理学杂志，2005(5)：311-312.
［2］ Xu J， Stolk JA， Zhang X， et al. Identification of differentially expressed genes in human prostate cancer using subtraction and microarray ［J］. Cancer Res，2000，60(6):1677-1682.
［3］ Luo J， Zha S， Gage WR， et al. Alpha2methylacyl2CoA racemase: a new molecular marker for prostate cancer ［J］. Cancer Res，2002，62(8):2220-2226.
［4］ Rubin MA， Zhou M， Dhanasekaran SM， et al. Alpha-methylacyl-coenzyme A racemase as a tissue biomarker for prostate cancer ［J］. JAMA，2000，287(2):1662-1670.
［5］ 胡志红，程玲，吴萍，等.Ck34βE12、P63和P504s联合检测在前列腺肿瘤鉴别诊断中的应用［J］.诊断病理学杂志，2005，12(2):123-125.
［6］ Kunju LP， Rubin MA， Chinnaiyan AM， et al. Diagnostic usefulness of monoclonal antibody p504S in the workup of atypical prostatic glandular proliferations ［J］. Am J Clin Pathol，2003，120(5):737-745.
［7］ 杜洪，李雯，梁颜笑.联合P504s、CK34βE12、P63检测在前列腺良恶性病变鉴别诊断中的应用［J］.中国医师进修杂志：综合版，2006，29(4)：4-6.
［8］ Gown AM， Vogel AM. Monoclonal antibodies to human intermediate filament proteins: Ⅱ. Distribution of filament proteins in normal human tissues ［J］. Am J Pathol，1984，114(2):309-321.
［9］ Genega EM， Hutchinson B， Reuter VE， et al. Immunophenotye of high-grade prostatic adenocarcinoma and urothelial carcinoma ［J］. Mod Pathol，2000，13(11):1186-1191.