作者：邢向晖，陈鲁，阎雁，刘玮
【摘要】 目的探讨防哮颗粒对哮喘缓解期气道炎性损伤的防治机理。方法制作大鼠哮喘缓解期模型，观察防哮颗粒浓缩液灌胃后对模型大鼠血清IFN|γ和TNF|α的影响，并与固本咳喘片、酮替芬对照组比较。结果防哮颗粒能升高哮喘缓解期模型大鼠血清中IFN|γ含量，降低TNF|α含量，且与中、西药对照组比较差异有高度统计意义（P&<0.01）。结论防哮颗粒可抑制模型大鼠气道炎症，降低气道高反应，故对哮喘缓解期模型大鼠气道炎性损伤具有良好的预防作用。
【关键词】 防哮颗粒；大鼠；哮喘缓解期；实验研究；IFN|γ；TNF|α
支气管哮喘是由嗜酸粒细胞、肥大细胞和T淋巴细胞等多种炎性细胞参与的气道慢性炎症，其气道变应性炎症的程度与哮喘发作程度呈正相关，无论在发作期还是缓解期，这种慢性炎症都不同程度地存在。近年来运用中医药防治本病取得了显著成果，但其作用机理有待进一步研究。为深化其作用机理，我们观察了防哮颗粒对哮喘缓解期模型大鼠血清IFN|γ和TNF|α的影响，现总结如下。
1实验材料
1.1 实验动物
选择健康Wistar大鼠40只，体质量(200±10)g，雌雄各半，由山东大学实验动物中心提供，符合一级实验动物(清洁级)标准。
1.2 试剂与药品
IFN|γ ELISA试剂盒和TNF|α ELISA试剂盒，均购于晶美生物工程（北京）有限公司。卵白蛋白粉剂（10 g/瓶），购于济南科瑞生物科技有限公司（Sigma公司分装）。酮替芬（1 mg/片），江苏天士力帝益药业有限公司生产（批号：20050521），研磨成末，用生理盐水配成质量浓度为0.02 mg/mL混悬液。固本咳喘片（0.4 g/片），台州南峰药业有限公司生产（批号：060305），研磨成末，用生理盐水配成质量浓度为0.02 mg/mL混悬液。防哮颗粒（8 g/袋），由山东中医药大学药学院药剂教研室按正交试验法筛选工艺，以最佳流程制备。组成：黄芪、白术、防风、陈皮、清半夏、熟地黄、淫羊藿、黄芩、蛤蚧、五味子、丹参。生药购于山东中医药大学附属医院药房。大鼠灌胃药以其制成浓缩液，每毫升含生药2 g。其他如生理盐水、0.4 ％戊巴比妥钠等。
1.3 实验仪器
益鸟牌超声雾化器(402型)：上海四菱医疗器械厂生产。电热恒温水箱(HW1型)：北京医疗设备厂生产。白洋牌自动平衡离心机(B80型)：白洋离心机厂生产。JA2003型电子称:由上海恒平科学仪器有限公司提供。Stat Fax－2100型酶标仪：美国AWARENESS公司生产。
2实验方法
将40只大鼠随机分成空白对照组、模型对照组、中药治疗组、中药对照组、西药对照组，每组8只，雌雄各半，常规饲养1周后致敏。除空白对照组外，其余各组大鼠常规皮肤消毒后腹腔注射10 ％卵白蛋白生理盐水1 mL致敏，常规饲养1周后放入密闭的动物造模雾室内，用卵白蛋白与生理盐水配成1 ％的液体，加入超声雾化器雾化进行大鼠哮喘诱发实验，记录大鼠喘息时的症状、体征（大鼠出现躁动不安、呼吸加速、腹部内凹等呼吸困难表现，说明诱发哮喘成功）。每日诱发哮喘30 min，连续诱发14 d。诱发实验结束后常规饲养1周，开始灌胃。根据“常用动物与人体面积比值”计算大鼠灌胃药量（D2=D1/R1×R2）[1]。中药治疗组每只每天用防哮颗粒9 g/kg，即0.9 mL；中药对照组(固本咳喘片)和西药对照组(酮替芬)按每只每天0.09 mg/kg给药，即0.9 mL；空白对照组、模型对照组大鼠以等量生理盐水代替，即每只每天用0.9 mL。共灌胃30 d。
灌胃结束后用0.4 ％戊巴比妥钠腹腔麻醉（1 mL/100 g）大鼠，腹主动脉取血，以3000 r/min离心5 min，取血清待用。采用ELISA法检测血清中INF|γ、TNF|α的含量（具体步骤按试剂说明进行操作）。
3统计方法
采用SPSS 12.0统计软件进行统计，计量资料采用t检验与方差分析，P&<0.05为差异有统计意义，P&<0.01为差异有高度统计意义。
4 实验结果
见表1。表1防哮颗粒对大鼠血清IFN|γ和INF|α含量的影响 注：与空白对照组比较☆☆P&<0.01;与模型对照组比较△P&<0.05，△△P&<0.01；与中药治疗组比较★★P&<0.01。
转贴于5 讨论
γ-干扰素（IFN|γ）作为Th1型细胞因子的代表，是一种对细胞功能具有调节作用的小分子多肽。首先在IgE合成方面，活化的Th1细胞产生的IFN|γ和活化的Th3细胞产生的IL|4可相互拮抗，从而调节IgE的生成和分泌。无论是外源性还是内源性IFN|γ均可降低致敏小鼠血浆IgE水平、降低气道高反应性和BALF中的浸润细胞数量[2]。同时，IFN|γ也是IL|4的拮抗因子，可通过抑制IL|4 mRNA转录水平，并抑制IL|4诱导的B细胞表达低亲和IgE受体与可溶性的低亲和IgE受体，从而抑制体内IgE生成[3-4]。其次，IFN|γ对气道嗜酸性粒细胞浸润具有抑制作用。国内的研究发现，IFN|γ能强烈抑制EOS聚集，并能够促进EOS活化和分化的GM|CSF水平降低[5]。此外，IFN|γ也是Th3淋巴细胞及包括上皮细胞在内的非淋巴细胞的负生长调控细胞因子，可抑制人的支气管上皮细胞增殖[6]。哮喘缓解期患儿仍然存在Th3/Th1亚群失衡，主要表现为外周血EOS升高、血清IgE升高、PBMC生成IL|4和IL|10增加。而IFN|γ阳性细胞百分比降低，PBMC中IL|4阳性细胞百分比增高， IL|4/IFN|γ比值增高，这可能是哮喘容易复发的原因之一[7]。
肿瘤坏死因子（TNF|α）是一种参与哮喘发生及进展的细胞因子，它由壁细胞、气道和组织的巨噬细胞、支气管上皮细胞分泌产生。TNF|α能增加气道的高反应性，诱发气道炎症。研究发现[7]，哮喘缓解期患者TNF|α水平仍高于正常人。TNF|α除作为一种重要的炎性介质外，同时也可作为各种细胞因子的启动因子，影响与哮喘有关的染色体遗传基因的改变，参与哮喘的整个病理生理过程和遗传过程。本实验表明：防哮颗粒能升高哮喘缓解期模型大鼠血清中IFN|γ，降低TNF|α的含量。证明防哮颗粒可抑制模型大鼠气道炎症，降低气道高反应，故对哮喘缓解期模型大鼠气道炎性损伤具有良好的预防作用。
《景岳全书·喘促》云：“未发时以扶正气为主，既发时以攻邪气为主。”《医宗必读·喘》：“治实者攻之即效，无所难也。治虚者补之未必即效，须悠久成功，其间转折进退，良非易也。”哮喘病在肺，源在脾，根在肾。缓解期肺、脾、肾三脏不足，兼有痰浊、瘀血。根据“急则治标，缓则治本”的治疗原则，确立以补肺、肾为主，补脾为辅，佐以化痰、活血的治疗大法。方中黄芪补肺气、益卫气；蛤蚧补肺气、纳肾气。两药合用，外御卫表，内补肺肾，共为君药。五味子上敛肺，下滋肾，助黄芪、蛤蚧补肺益肾涩精，为臣药。熟地黄、淫羊藿补肾阳、滋肾阴，以培先天；白术、陈皮、清半夏补益脾肺，理气化痰，以滋后天。共为佐助之品。黄芩清伏痰蕴郁之热，且防诸药辛燥、温热太过，为佐制之品。丹参活血行血，化瘀走里；防风辛散透达，助黄芪御表。共为使药。诸药合用，共有补肾固本、益气固表、祛痰通络、虚实并治、标本兼顾之效。
参考文献
[1]高治平，胡弼.现代实用医学机能实验技术与方法[M].长沙：湖南科学技术出版社，2004：18.
[2]Hofstra C L，Van Ark J，Hofiman G，et al.Different effects of endogenous and esogenous interferon gamma on immunoglobulin E，cellular infiltration，and airway respinsivenessin amuine model of allergy asthma[J].Am J Respir Cell Mol，1998，19(5):82-83.
[3]王华强，张世明，李强.白细胞介素-4和干扰素-γ在哮喘发病机制中的研究[J].解放军医学杂志，1997，22(1):57-59.
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[5]阳显慧，许辉，陈一强，等.γ-干扰素对哮喘气道炎症的影响[J].广西医科大学学报，1997，14(3):27-30.
[6]毛晓辉，倪殿涛.干扰素-γ在支气管哮喘发病中的作用[J].细胞与分子免疫学杂志，2003，19(4):415-416.
[7]赵文利，孔祥英，何念海.支气管哮喘缓解期患儿T辅助细胞功能状态评估[J].重庆医学，2004，33(8):1211-1213.