关于神经节苷脂对大鼠缺血后脑水肿脑组织中AQP4mRNA表达的影响

【摘要】 目的 探讨神经节苷脂对大鼠缺血后脑水肿脑组织中AQP4mRNA表达的影响。方法 线栓法复制脑缺血大鼠模型，于缺血后6h、1、3、5、7d观察模型大鼠脑组织含水量及AQP4mRNA的表达。结果 手术组大鼠脑组织水含量及AQP4mRNA的表达于6h后升高，3d达高峰，较假手术组和神经节苷脂组显著升高（P&<0.05）。结论 神经节苷脂能够降低脑梗死大鼠脑组织水含量及AQP4mRNA的表达，减轻脑水肿。

【关键词】 脑水肿；水通道蛋白4；神经节苷脂

　　【Abstract】 Objective To observe the effect of GM1 on expression of AQP4mRNA after ischemic brain edema in rats.Methods The rat model of cerebral ischemic was established by inserting nylon thread. Changes of brain water content and expression of AQP4mRNA were examined after cerebral ischemic at 6h，1d，3d，5d，7d.Results The brain water content and expression of AQP4mRNA of surgery group increased at 6h and reached the peak at 3d，they were obviously higher than that in the false surgery group and the GM1 group(P&<0.05).Conclusion GM1 can decrease the degree of brain edema by reducing brain water content and expression of AQP4mRNA .
　　
　　【Key words】 Brain edema; AQP4; GM1
　　
　　神经节苷脂(GM1)系细胞膜的重要成分之一，在中枢神经系统中最丰富，具有促进神经再生、神经轴突生长、突触形成和恢复神经支配功能。研究表明GM1对缺血神经元具有保护作用，其机制之一为减轻脑水肿［1］。水通道蛋白（aquaporin AQP）是近年来发现的一组与水通透有关的细胞膜转运蛋白，与缺血性脑水肿的发生关系密切，脑组织中主要是水通道蛋白4（AQP4）［2］。但GM1对AQP4的影响报到尚少，本实验通过研究GM1对AQP4的影响，进一步阐明GM1的脑保护机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠75只，体质量250～300g，随机分3组：假手术组、手术组、神经节苷脂组，各25只。各组分别按6h、1、3、5、7d时间点成5个亚组，每个亚组5只。

　　1.2 动物模型制备 大脑中动脉闭塞（MCAO）模型 参照Zea Longa线栓法。以水合氯醛腹腔麻醉分离并结扎左颈总、颈外动脉，在左颈总动脉近交叉约5mm处切口，用直径0.26mm的鱼线插入颈内动脉，深度18～20mm，结扎颈内动脉。假手术组颈内动脉不插鱼线。鱼线插入组鱼线插入并固定后腹腔注入鱼线插入（10mg/kg，）以后每24h一次。

　　1.3 指标检测

　　1.3.1 脑组织含水量测定：取大鼠右侧脑组织称湿重，后于95～100℃烤箱中烘烤24h后称干重，按如下公式计算脑组织含水量百分比：脑组织含水量=（湿重-干重）/湿重×100%。

　　1.3.2 AQP4mRNA的测定：分别对各组脑组织制备匀浆，采用Trizol提取脑组织总RNA，紫外分光光度仪测定RNA含量，采用MMLV试剂盒中步骤将RNA逆转录成cDNA，再将cDNA进行PCR扩增，取扩增产物进行电泳，用凝胶图像分析系统进行电泳条带光密度分析，计算AQP4产物和βactin产物光密度积分的比值，作为AQP4mRNA表达的指标。

　　1.4 统计学处理 各实验组数据用±s表示，多组之间采用单因素方差分析。采用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理。

　　2 结果

　　表1 各实验组脑水含量的变化（略）

　　注：与假手术组相比，△P&<0.05；与手术组相比，▲P&<0.05

　　2.1 脑组织水含量测定 结果手术组脑组织水含量于6h开始升高，3d达高峰，而后下降，7d仍高于正常。GM1组与手术组比较，各时间点脑组织水含量均显著下降（P &<0.05），见表1。

　　2.2 AQP4mRNA的表达 手术组脑组织AQP4mRNA的表达较假手术组明显升高，差异有统计学意义（P&<0.05），GM1组与手术组比较，各时间点脑组织AQP4mRNA的表达均明显下降，差异有统计学意义（P&<0.05）。见表2。

　　表2 各实验组AQP4mRNA的变化（略）

　　注：与假手术组相比，△P&<0.05；与手术组相比，▲P&<0.05

　　2.3 脑组织水含量与AQP4mRNA表达的相关分析 由表1和表2分析得出：r=0.776，P&<0.01，提示水含量与AQP4mRNA的表达正相关。

　　3 讨论
　　
　　本实验采用线栓法致大鼠脑缺血，诱发脑水肿，与脑梗死后水肿形成的病理生理过程相似。脑组织水含量于6h开始升高，3d达高峰，而后下降，7d仍高于正常。手术组各时间点脑组织水含量均高于假手术组（P&<0.05）。

　　水通道蛋白是一个高选择性、低活化能转运水分子的跨膜通道蛋白家族。目前已鉴定出至少11种水通道蛋白，依次命名为AQP 0～10。AQP家族可分两类:一类只允许水分子通过，属于选择性水通道，包括AQP0、1、2、4、5、6;另一类AQP则同时允许水分子和其他的中性小分子(如甘油，尿素)通过，包括AQP3、7、9。AQP4广泛存在于脑星形胶质细胞膜的足板、蛛网膜下隙、血管周围的胶质细胞、室管膜细胞、脉络丛上皮及下丘脑的视上核、室旁核及海马齿状回和小脑。由于星形胶质细胞是血脑屏障(BBB)的重要组成部分，所以，AQP4的表达对于BBB的功能调节有密切关系。当AQP4表达上调时，可引起神经胶质细胞足突水肿，进而使BBB遭到破坏，导致脑水肿。在脑水肿组织中可见AQP4的表达上调。缺乏AQP4的星形细胞对水的通透能力下降达7倍［3］。Manley等［4］通过建立大鼠的大脑中动脉栓塞脑缺血后水肿模型，发现与野生型鼠相比，AQP4敲除大鼠的星形胶质细胞足突的膨胀程度较轻。Taniguchi等［5］发现在栓塞周围皮质的AQP4 mRNA在缺血后第1天表达轻微上调，第3天达到高峰，第7天仍处于较高水平，与磁共振监测的脑水肿变化相一致，从而说明了AQP4参与了缺血后脑水肿的形成。国内对脑卒中后脑水肿与AQP4表达的研究发现［68］，AQP4蛋白的表达和脑水含量呈正相关，AQP4表达上调是形成细胞内水肿的关键因素，在脑缺血/再灌注损伤中，AQP4水平的迅速下降可能是机体对脑损伤作出的一种保护性反应。本实验得出类似结果，手术组AQP4mRNA表达6 h开始升高，3 d时达到高峰。手术组AQP4mRNA表达均高于假手术组，有显著性差异(P&<0.05)。从脑水含量与AQP4mRNA表达的相关分析可以看出，二者变化规律一致，具有正性相关。提示AQP4mRNA的表达与脑水肿的程度呈正比关系。
　　
　　神经节苷脂是一组含有唾液酸的鞘糖脂，神经节苷脂(即单唾液酸四已糖神经节苷脂)是哺乳类神经节苷脂的主要种类。以往研究［1］表明GM1可抑制脑水肿的发生，这种作用可能与恢复Na+K+ATPase，Ca2+Mg2+ATPase活性有关。本实验中， GM1组的脑水含量及AQP4mRNA表达均比手术组低，说明GM1可以下调水肿组织的AQP4mRNA表达，从而减轻脑水肿，起到保护脑细胞的作用。但对于AQP4调节的分子机制尚需进一步研究。

【参考文献】
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