荧光定量PCR检测在核苷(酸)类药物治疗乙型肝炎耐药临床分析中的应用价值慢性

（论文网） 　　 1 研究背景
　　慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染呈全球分布，我国是乙型肝炎的高发区，约有慢性乙型肝炎(CHB)患者3000万人，其中每年有30万人死于与CHB相关的肝硬化及肝癌。抗病毒治疗对干预慢性HBV感染的病程进展乃至减少严重并发症的发生是非常必要的，可以有效提高患者的生存质量。目前两类抗病毒药物[干扰素和核苷(酸)类药物]中，由于核苷(酸)类药物(NA)适应症广、口服方便以及不良反应较低等原因，在我国运用广泛。HBV的高变异性以及NA应用人群的广泛，使得NA耐药问题也日趋严重。患者在出现NA耐药相关变异后，可以相继出现病毒学突破、生化学反弹、肝炎发作和肝功能失代偿等。因此，定期监测、早期发现NA耐药并给予合理的挽救治疗对于有效地控制HBV感染、改善预后具有重要意义。
　　2 研究目的
　　2.1对NA相关耐药的病例进行临床分析研究，以期总结出该耐药人群的临床特征，从而可以在耐药检测前或不具备耐药检测条件时对患者的耐药情况进行初步判断，以备指导挽救治疗。
　　2.2核苷(酸)类药物(NA)长期抗HBV治疗面临的最重要问题之一是HBV的耐药性问题。目前所有口服核苷(酸)类似物，包括拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦和替比夫定，治疗过程中均可出现耐药性。特别是最近报道发现未用过阿德福韦的患者对阿德福韦原发耐药、序贯联合核苷(酸)类似物治疗的患者出现多重耐药性等更引起临床医师的高度关注。
　　3 研究方法
　　3.1收集2004年4月至2011年2月我院800例乙型肝炎病毒感染者和无症状查体者，其中女289例，男511例。年龄9～78岁，平均38岁。清晨空腹静脉取血2ml送检。其中确诊慢性乙型肝炎经NA治疗6个月以上出现治疗应答不良CHB患者的血清，提取其DNA模板，以备患者血清HBV DNA水平检测。
　　3.2拉米夫定(LAM)是第一个被批准用于治疗慢性乙型肝炎的核苷类似物，因其抗病毒作用确切，近些年在临床上得到广泛应用。但部分患者长期服用LAM可发生耐药，主要由乙型肝炎病毒(HBV)聚合酶YMDD基序及RT区发生变异所引起，当YMDD变异株成为优势株时就会影响其抗病毒疗效。
　　3.3观察拉米夫定(LAM)耐药后单用或联合阿德福韦酯(ADV)治疗应答欠佳患者HBV耐药变异模式 方法：收集15例LAM耐药后采用ADV治疗病毒学应答欠佳患者的血清，对HBV聚合酶逆转录区进行聚合酶链反应、扩增、克隆、测序，分析与耐药相关的变异模式。组间HBV DNA水平比较采用t检验。结果：单用ADV组和联合治疗组患者血清HBV DNA水平分别为(3.86±0.85)log10拷贝/ml和(5.71±0.94)log10拷贝/ml，差异有统计学意义(t=3.947，P&<0.01)。结论：LAM耐药后ADV治疗病毒学应答欠佳的患者中，单用ADV治疗比联合治疗时更不容易发生耐药性。 　　 3.4观察恩替卡韦(ETV)治疗拉米夫定失效慢性乙型肝炎(CHB)的病毒学应答和耐药情况 对接受口服ETV(1.0mg/d，治疗疗程&>12个月，基线HBV DNA≥101拷贝/ml)治疗的拉米夫定失效的100例CHB患者进行临床随访，定期检测其血清HBV DNA定量、乙型肝炎病毒标志物、肝功能及耐药情况。结果：100例患者接受ETV1.0mg/d治疗12个月时，50%(50/100)的患者HBV DNA转阴(&<103拷贝/ml)，64%基线ALT水平异常的患者ALT水平恢复正常(&<40U/L)，2例(7.7%)HBeAg阳性患者分别在治疗第10、12个月时获得HBeAg血清学转换。1例患者发生了ETV基因型耐药变异。结论：ETV(1.0mg/d)治疗拉米夫定失效CHB有效，但应警惕耐药变异的发生。
　　3.5对NA相关耐药的病例进行临床分析，并总结长期使用NA应答不良人群中耐药患者的特定临床特征。
　　4 研究结果
　　4.1第一部分研究中100例标本通过荧光定量PCR法扩增均获得可供判断是否耐药的HBV DNA产物。NA治疗6个月以上，50%(50/100)的患者HBV DNA转阴(&<103拷贝/ml)，64%基线ALT水平异常的患者ALT水平恢复正常(&<40U/L)，2例(7.7%)HBeAg阳性患者分别在治疗第10、12个月时获得HBeAg血清学转换。1例患者发生了ETV基因型耐药变异。
　　4.2ADV相关耐药变异者基因型耐药检测阳性组的ADV平均疗程明显长于检测阴性组，差异具有统计学意义(t=5.110，P&<0.001)。
　　4.3比较LAM及ADV相关耐药检测阳性与阴性者的即刻HBV DNA载量，LAM相关耐药检测阳性和阴性者HBV DNA载量相近，ADV相关耐药检测阳性者比阴性者稍高，两者差别均无统计学意义（P=0.655，P=0.2837）。
　　4.4发生病毒学突破(或反弹)组耐药检测阳性率明显高于原发无应答组，差异有统计学意义(x2=7.49，P=0.006)。
　　4.5LAM治疗失败ADV再治疗患者比ADV初治组耐药检出率高，差异有统计学意义(x2=6.564，P=0.001)。
　　4.6多药治疗者的耐药发生率明显高于单一用药者，且多位点联合耐药发生率高(P&<0.0001，P=0.004)。
　　5 结论
　　5.1本研究提示经过对长期NA治疗患者的HBV-DNA PCR的定期复查结果对了解长期NA治疗患者体内病毒种群的变异、正确制定应对措施、防止多药耐药具有很重要的作用。
　　5.2长期NA治疗应答不良患者经HBV-DNA PCR的定期复查阳性转阴结果分析，其耐药高危人群的临床特征是：多药使用者、病毒学突破(或反弹)者、长疗程ADV用药者。鉴于PCR产物直接测序法尚未普及开展，因此了解这些高危人群的特点对于在耐药检测前或不具备耐药检测条件时对患者的耐药情况进行初步判断、进而挽救治疗具有指导意义。
　　参 考 文 献
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