洛四联症患儿22q11区微缺失的分析

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　　法洛四联症(tetralogy of Fallot’ TOF)是最常见的青紫型先天性心脏病(简称先心病，conotruncal cardiac defects’ CTD)，尽管多数为单纯心脏畸形，亦有一部分合并于一些遗传综合征，如DiGeorge综合征(DGS)、腭-心-面综合征(VCFS)等［1］。DGS中80%以上存在22q11区基因的微缺失［2］，相同区域的缺失亦在一部分单纯TOF患儿中发现［3］。在缺失区域及其两侧存在着多个具有多态性的微卫星DNA标记，该区的多个微卫星标记及它们在22号染色体上的分布见文献［4］。微卫星DNA广泛分布于基因组中，具有高度多态性、遗传稳定性高等优点。据报道，以聚合酶链反应技术为基础标记微卫星的基因分型技术，可检测出圆锥动脉干缺损型先心病中95%以上的22q11区缺失［5］。我们选取该区的5个微卫星DNA标记：D22S420、D22S941、D22S944、D22S311与D22S306，对中国汉族正常人及TOF患儿进行分子遗传学方面的研究，以检测TOF患儿该区域的缺失，为基因诊断、遗传咨询提供基础。
　　1　对象与方法
　　1.1　对象　(1)无血缘关系的汉族健康个体50名。(2)在新华医院心血管病专科门诊与病房随机选择无血缘关系的23例TOF患儿及其父母，所有病例均经临床、超声波与心导管检查确诊。
　　1.2　方法
　　1.2.1　外周血基因组DNA抽提　取前臂静脉血4 ml，经EDTA抗凝，分离白细胞，蛋白酶K37 ℃消化24 h，常规酚、氯仿抽提，溶于200～400 μl pH 8.0 TE。
　　1.2.2　PCR扩增　引物序列参照文献［4］，由上海生工生物工程有限公司合成。D22S420：上游5′-TGTTCTACACTGAA-AATTCTGACGG-3′，下游5′-GAGGGCGTTATCCATGACC-3′；D22S941：上游5′-CAGGTTACAAAGTACATTAACTT-3′，下游5′-CAAGAAATGGTTGGAGCTGGT-3′；D22S944：上游5′-CATGTGAAAGATGCTACTTCC-3′，下游5′-ATCCC-ATGCTCCTCCCCAT-3′；D22S311：上游5′-GCTAGTGTGA-GATAACGAAGCC-3′，下游5′-TT-TTTGTATTTTTAGT-AGAGACGG-3′；D22S306：上游5′-GCCATTTATACAGT-CTGGACC-3′，下游5′-CTCTTTCGCTGGAACATCAAA-3′。PCR反应体系为15 μl，其中含有100 μmol/L dTTP、dGTP与dCTP；30 μmol/L dATP；0.5 μmol/L引物；100 ng DNA；0.6 U Taq E;32P-dATP 0.1 μl；加石蜡油覆盖。PCR扩增条件：94 ℃变性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃～65 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。
　　1.2.3　扩增片段长度多态性检测　扩增产物2 μl与2 μl加样液(含0.025%溴酚蓝，0.025%二甲苯青，95%甲酰胺，20 μmol/L EDTA)混匀经88 ℃变性8 min，迅速移入冰浴中，点样于厚0.4 mm、长35 cm的6%变性聚丙烯酰氨胶，电泳缓冲液为1×TBE，38 W电泳2.5～3.5 h，再以固定液(10%的甲醇，10%冰乙酸)处理15 min，凝胶干燥器上80 ℃干燥1 h，放射自显影6～24 h。
　　1.2.4　确定扩增片段的大小　采用测序产物作为DNA分子量的标准，将测序产物与扩增产物一起电泳，以确定扩增片段的大小。
　　1.2.5　多态信息量(PIC)计算：
　　(其中n为该位点的等位基因数，Pi为第i个等位基因在群体中的频率)。
　　2　结果
　　2.1　多态性分析　50名中国汉族健康个体的各个微卫星位点经PCR扩增后，应用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA片段，等位基因片段在群体中显示多态现象。 　2.2　TOF患儿及其父母的多态性分析　所检测的5个微卫星位点在TOF患儿及其父母中的等位基因片段长度及数目与正常人接近。正常人群、TOF患儿及其父母5个微卫星位点的杂合率，23例患儿的主要临床资料与多态性分析。
　　在本组23个TOF家庭中，家系分析示6个TOF患儿存在基因缺失。患儿例8、例12为D22S941、D22S311位点缺失，是母源性丢失；例15、例16、例19为D22S941位点缺失，是父源性丢失；例21为D22S941位点缺失，是母源性丢失。
　　2.3　缺失边界的确定　应用这五个微卫星标记在22q11染色体上的分布对缺失边界进行定位，在受检病例中发现如下几种不同的缺失区域：基因缺失两个断裂点在D22S420与D22S941、D22S311与D22S306之间，如病例8、12；基因缺失两个断裂点在D22S420与D22S941、D22S941与D22S944之间，如病例15、16；基因缺失两个断裂点在D22S941与D22S944、D22S944与D22S311之间，如病例21；基因缺失断裂点无法确定，如病例19。将本研究中检测出有基因缺失的患儿与没有基因缺失的患儿之间的临床表现相比较，我们可发现有无这五个微卫星标记可检测出的基因缺失、缺失范围的大小与疾病的严重程度无明显相关。
　　3　讨论
　　先心病是最常见的先天性畸形之一，TOF是最常见的青紫型先心病。长期以来，先心病一直被认为由多因素作用引起，但随着分子水平研究的不断进展，这一观点正面临严峻的挑战。本世纪60年代，细胞遗传学的研究发现，与TOF相关的遗传综合征DGS、VCFS病例中约15%存在22q11区基因单拷贝的缺失。随着分子遗传学研究的发展，1989年发现约90%的DGS在该区有微缺失，这个区域的微缺失亦在大部分VCFS、20%～30%单纯CTD散发患儿及TOF患儿中检测出［2，3，6］。
　　本组23例TOF患儿中，6/23(26.09%)存在22q11区缺失，有无这五个标记可检测出的缺失、缺失范围的大小与疾病的严重程度无明显相关。Goldmuntz等［6］报道，在CTD中，29.4%(5/17)存在22q11区的基因缺失；Trainer等［3］报道，在TOF中，21.2%(7/33)存在22q11区的基因缺失，缺失基因的有无、缺失片段的大小与疾病的严重程度无明显相关，这些结果与我们的结论相一致。我们检测的5个微卫星位点的等位基因片段长度及数目与Morrow等［4］的研究一致，但D22S420、D22S944、D22S311和D22S306位点的杂合率存在较大差异［4］。
　　缺失区域很大，为2 Mb左右，在该区域中已分离出一系列基因，包括DGCR1、DGCR5、CTP、CLATHRIN、DVL22等［7］。在这些基因中，哪个基因在心脏的发生中起着更重要的作用，影响着圆锥动脉干部的发生尚不清楚，确认关键基因将有助于进一步检测关键基因的点突变与微小的缺失，这些都有待于进一步研究。转贴于