脱水休眠小卷蛾斯氏线虫的生化特性分析

关键字： 昆虫病　线虫
　　昆虫病原线虫是生物防治的重要作用物，但由于不耐干燥和高温，限制了其应用范围。因休眠线虫具有抵抗不良环境的能力(Glazer’1983)，通过胁迫昆虫病原线虫脱水休眠，可提高其对外界环境的抗性，由过去低温存储运输方式变为常温存储运输，进而降低成本，扩大应用范围。至今为止胁迫线虫脱水休眠的方法有蒸发胁迫和高渗液胁迫两种(Womersley’1990;陈松笔，1998)。通过这两种方法使线虫体内水分逐渐脱出，从而降低细胞中原生质的水分含量，使线虫代谢强度逐渐减弱而进入休眠状态。然而体内水分脱去多少，线虫才进入休眠，尚未见报导。
　　线虫脱水休眠除与水分有关以外，还与体内脂肪、脂肪酸、海藻糖和糖元的含量相关。蒸发胁迫脱水休眠后，线虫耗氧量减少，体内脂肪含量升高(Bird’1980)，但也有人提出异议，Madin(1975)认为燕麦真滑刃线虫Aphelenchus avenae(Bastian)经蒸发胁迫缓慢脱水过程中体内脂肪含量降低，海藻糖含量上升。Womersley(1990)也指出未处理的小卷蛾斯氏线虫Steinernema carpocapsae(All)侵染斯线虫脂类和糖元含量约占干重的30%和4%，然在RH97%处理3d之后，脂类和糖元含量分别变为24%和0；相反海藻糖含量在未处理前少于干重的0.2%，脱水后增加到7%，脂肪酸相对含量也由处理前的13.2%降低到4.4%。不同线虫在脱水休眠过程中海藻糖和糖元含量也存在差异，蒸发胁迫脱水休眠的小麦粒瘿线虫Anguina tritici(Steinbuch)和起绒草茎线虫Ditylenchus dipsaci(Kühn)体内优先贮存海藻糖，而不是糖原，Paragrellus repivus和Turbatrix aceti却含有大量的糖元，海藻糖含量极微，食菌茎线虫Ditylenchus myceliophagus (Goodey)含有少量的糖元和极微量的海藻糖(Womersley’1982)。虽然线虫脱水休眠后，体内脂肪、脂肪酸和糖含量均有变化，但海藻糖在脱水休眠中起的作用却大些，因为海藻糖在脱水休眠前有保护膜系统的潜力，根据对模型膜系统的研究得出一定数量海藻糖(0.3g海藻糖/g膜)的出现能防止结构水丢失时，膦脂双分子层变形，从而保持膜结构和功能的完整性(Crowe’1984;Crowe’1984;Womersley’1986)。
　　采用高渗液胁迫线虫脱水休眠比之蒸发胁迫方法，快速、安全，此法简单、适用，能为生产提供大量的休眠线虫，为常温贮存、长途运输和应用提供保证。是胁迫线虫脱水休眠的较佳方法，但对此法得出脱水休眠线虫体内脂肪、脂肪酸、糖的情况尚未了解。本文通过采用高渗液胁迫小卷蛾斯氏线虫脱水休眠，研究其生化特性，对揭示高渗液胁迫线虫脱水休眠的机制起到一定的促进作用。
　　1　材料和方法
　　1.1　大蜡螟幼虫和斯氏线虫BJ品系
　　大蜡螟(Galleria mellonella L.)幼虫为室内饲养。小卷蛾斯氏线虫BJ品系的繁殖采用Dutky(1964)的大蜡螟活体繁殖法。
　　1.2　脱水休眠小卷蛾线虫的制备
　　在250mL的三角瓶里，配制SB高渗液20mL，投入小卷蛾斯氏线虫BJ品系约2.5×106条，在10h内胁迫线虫逐渐脱水休眠。
　　1.3　脱水休眠线虫含水量的测定
　　取约107条脱水休眠线虫BJ品系，真空抽滤，除去线虫表面的高渗液，转到已经称重的坩埚中，在Sartorius电子天平上称得线虫的鲜重(W1)；然后在台式干燥箱内(70℃，48h)烘干直至恒重，称重，除去坩埚重量，即为休眠线虫干重(W2)，重复3次。用未处理线虫为对照(华东师范大学生物系植物生理教研组，1980)。
　　1.4　脱水休眠线虫粗脂肪的测定
　　采用索氏提取法测定休眠线虫粗脂肪的百分含量(朱俭，1981)，用未处理线虫作对照。
　　1.5　脱水休眠线虫酯酶活性的测定
　　测定脱水休眠线虫的酯酶活性参照吴振廷(1988)方法。脱水休眠线虫106条经真空抽滤，在-18℃冰箱中冷冻5min，再转到0℃冰槽的玻璃研钵中研磨2min后，加入1mL pH为7.4的0.2mol/L磷酸缓冲液，又研磨2min，研磨毕加进此缓冲液1mL，再将研磨液转入容量为4mL的指形离心管内，0℃下以5 000r/min转速离心10min，吸出上清液，立即放在0℃冰箱保存备用。
　　在长指形管中均加入10mL 0.01mol/L的乙酸α-萘酯溶液，加入3mL蒸馏水稀释，分别加进线虫酶液50μL’以未处理线虫作对照，用50μl重蒸水代替酶液做空白对照调零，振荡5min后，立即加入5滴坚牢兰RR盐显色剂显色，在紫外/可见分光光度计上于600nm处测定其光密度(OD)值。用未处理线虫作对照。 　　1.6　脱水休眠线虫脂肪酸的测定
　　采用气相色谱法测定休眠线虫的脂肪酸含量(Yang’1997)。用未处理线虫作对照。
　　1.7　脱水休眠线虫总糖、糖原和海藻糖的测定
　　采用蒽酮比色法测定脱水休眠线虫总糖、糖原和海藻糖的含量(冯慧，1989)。用未处理的线虫作对照。
　　1.8　数据分析
　　试验数据的显著性分析采用Scheffe方法，分析软件为Statgraf。
　　2　结果
　　2.1　脱水休眠线虫的含水量
　　脱水休眠线虫体内含水量与对照差异显著。其体内含水量为44.65%，与对照68.98%相比，含水量低24%左右。这一结果似乎表明小卷蛾线虫体内水分脱掉24%时，就能进入休眠。
　　2.2　脱水休眠线虫的粗脂肪含量
　　粗脂肪含有脂肪、游离脂肪酸、磷脂、酯、固醇、芳香油、某些色素及有机酸等。脱水休眠后线虫粗脂肪含量占干重38.5%，与对照38.0%差异不显著，说明在脱水休眠过程中，线虫没有消耗体内粗脂肪。
　　2.3　脱水休眠线虫的酯酶活性
　　酯酶存在于所有动物的器官内，不仅能水解具有一元醇的有机酸单酯，还可水解脂肪和甘油酯，其活性大小是脂类代谢的重要标志。线虫脱水进入休眠后酯酶活性降低，其OD值为0.085，与对照0.274相比差异显著。
　　2.4　脱水休眠线虫的脂肪酸含量
　　显示出线虫脱水休眠前后的脂肪酸含量处于稳定状态。脱水进入休眠后，线虫体内饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的含量分别为27.24%和62.26%，与对照没有显著性差异。
　　3　讨论
　　休眠是生物对外界不良环境的一种适应。昆虫病原小卷蛾斯氏线虫Steinernema carpocapsae BJ在SB高渗液里脱水休眠后，代谢减慢，耗氧量降低，休眠线虫加水后，几乎100%复苏，复苏线虫侵染力上升，脱水休眠线虫在大蜡螟体内生长发育没有受到不良影响(陈松笔，1998)，但脱水休眠小卷蛾斯氏线虫的粗脂肪和脂肪酸相对含量在脱水休眠前后保持不变，此结果和Bird (1980)、Madin && Crowe (1975)和Womersley (1990)报道的不一样。可能是小卷蛾斯氏线虫在脱水休眠过程中主要消耗糖原作为能量，以抵抗来自外界不良环境的压力(Patel，1996)，由于线虫在高渗液中脱水进入休眠仅10h，短于蒸发胁迫脱水休眠所需时间(3d以上)，线虫毋需消耗体内脂肪就进入休眠，且进入休眠后酯酶活性降低，故脱水休眠后，线虫体内脂肪和脂肪酸保持不变。在脱水休眠中线虫体内海藻糖含量稍为上升，与Womersley(1990)报导的海藻糖含量极度上升不同，推测可能是脱水进入休眠时间过短，致使海藻糖积累不多。结果究竟如何?尚待进一步探讨。