【关键词】高效液相色谱法；小鼠；肾脏；10-羟基喜树碱； 组织分布
喜树碱（Camptothecin，CPT）是从我国珙桐科植物喜树（Camptotheca acuminata Decne）中提取得到的一类天然生物碱[1]，具有显著的广谱抗肿瘤活性[2]。10-羟基喜树碱（10-hydroxycamptothecin，HCPT）是喜树碱的天然衍生物，是我国临床应用的喜树碱类抗肿瘤药物。目前已经有文献[3～8]报道检测血浆中HCPT含量的高效液相色谱法，但一般采用紫外检测器及使用外标法定量，灵敏度和准确度较低。本研究采用荧光检测器，以CPT 为内标，乙醚为萃取溶剂制备样品，建立了一种选择性好、灵敏度高的测定小鼠肾组织中HCPT浓度的高效液相色谱法，并将其应用于HCPT的肾组织中药动学研究。
1仪器与材料
1.1仪器:高效液相色谱系统，包括1525 型二元泵、717 型自动进样器、2475 型荧光检测器（美国Waters 公司）；Sorvall Legend Micro17 型离心机（美国Thermo 公司）；H-H-2 数显恒温水浴锅（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；WH-986 静音混合器和WH-861漩涡混合器（江苏省太仓市科教器材厂）。
1.2试药:HCPT（批号：081020，纯度：99％）、CPT（批号：080510，纯度：99％）购自哈尔滨峰源高科技开发有限公司；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
1.3动物：洁净级ICR小鼠，♂，体重20～25 g，购自黑龙江中医药大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK黑2008004。
2方法与结果
2.1色谱条件：色谱柱：Luna C1（8 250 mm×4.6 mm，5μm）；流速：1.2 mL·min-1；荧光检测器检测；激发波长：383 nm；发射波长：553 nm；流动相：水（A）-甲醇（B），梯度洗脱，详细梯度洗脱条件见表1。
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2.2溶液的制备:精密称取HCPT 或CPT 各1 mg，用甲醇溶解，定容至25mL，分别得浓度为40 μg·mL-1贮备液，分装，－80 ℃冰箱保存备用。试验时，用甲醇将HCPT 贮备液稀释成浓度分别为1.25、2.5、5、10、20、40、80 ng·mL-1的系列标准溶液；用甲醇将CPT 贮备液稀释成浓度为200 ng·mL-1 的溶液作为内标溶液，－80 ℃冰箱保存备用。
2.3动物实验:雄性小鼠禁食、自由饮水12小时，共3只小鼠按80 mg·kg-1羟基喜树碱的剂量灌胃给药。给药后24小时，取出肾组织，用生理盐水去除表面浮血，放入离心管中，置-20 ℃冰柜冷冻保存。RP-HPLC法测定生物样品中HCPT的含量，所得数据用药动学计算软件（Kinetics 5.0）分析。
2.4样品制备
2.4.1标准曲线的制备:以HCPT标准肾组织样品浓度为横坐标，以色谱图中HCPT峰面积与CPT峰面积之比为纵坐标绘制浓度标准曲线，采用加权最小二乘法进行回归运算，求得直线回归方程即为标准曲线。HCPT在检测浓度线性范围为1.25-80 ng·mL-1。小鼠肾组织样品典型的标准曲线回归方程Y=0.1627x+0.19090， r2=0.9993生物样品的制备。
2.4.2空白组织（肾组织）样品制备:取空白组织匀浆100 μL，依次加入内标溶液、HCPT系列标准溶液各100 μL和1%乙酸200 μL，加入乙醚约700 μL，将混合液涡旋1 min、静音混合60 min后，13 000 rpm离心20 min，萃取液置于干净的离心管中，40 ℃水浴，空气流吹干，最后用乙腈200 μL溶解，12 000 rpm离心5 min，取上清液50 μL进样。
2.4.3给药后组织（肾组织）样品制备：取乙腈100 μL代替空白组织，依次加入内标溶液、给药后组织匀浆各100 μL和1%乙酸200 μL，加入乙醚约700 μL，将混合液涡旋1 min、静音混合60 min后，13 000 rpm离心20 min，萃取液置于干净的离心管中，40 ℃水浴，空气流吹干，最后用乙腈200 μL溶解，12 000 rpm离心5 min，取上清液50 μL进样。
2.5系统适用性试验：按“空白组织分析样品的制备”方法处理并分析，得到空白组织的色谱图；同法操作，获得一定浓度HCPT标准样品的色谱图及小鼠灌胃给药后组织样品的色谱图（图1）。结果表明，肾组织中的内源性物质不干扰HCPT的测定。
2.6方法回收率和精密度试验：按“测定肾组织样品的HCPT溶液和内标CPT溶液”项下方法配制低、中、高三个浓度HCPT的质量控制（QC）样品，按“空白组织分析样品的制备”项下方法处理后进样，一天连续测定6次，随行标准曲线，计算日内精密度与准确度；每日各浓度1次，连续测定6天，随行标准曲线，计算肾组织样品测定方法日间精密度与准确度(表2)。结果，日内的RSD&<10.83%，日内精密度在89.82%~109.41%之间。日间的RSD&<10.03%，日间精密度在89.82%~106.73%之间。
2.7肾组织药代动力学：制作小鼠灌胃给药HCPT在肾组织中的药时曲线。图2是小鼠灌胃给药HCPT后肾脏中HCPT浓度与时间关系曲线。
图1肾脏色谱图
（A）小鼠空白肾脏样品；（B）小鼠空白肾脏中加入HCPT（20 ng·mL-1）和内标（CPT 200 ng·mL-1）；（C）小鼠灌胃给药后的肾脏样品和内标（CPT 200 ng·mL-1）
3讨论
CPT和HCPT均为水不溶性物质，但化学结构中E环闭合的内酯结构在碱性条件下可开环形成可溶于水的羧酸盐形式，因此在分析样品中加入1％乙酸，以保证其E环内酯结构处于闭合状态。为了防止水溶性杂质对样品分析的干扰和对色谱柱的损坏，本研究采用液-液萃取法来处理样品，以乙醚为萃取剂。作者比较了不同梯度洗脱和等度洗脱条件对试验的影响，结果表明，梯度洗脱峰形优于等度洗脱，在选定的梯度洗脱条件下HCPT和内标与杂质均可实现良好分离。
图2单剂量灌胃HCPT的小鼠肾脏中浓度-时间曲线
参考文献
[1]Wall ME，Wani MC，Cook CE，et al. Plant antitumor agent Ⅰ. The isolation and structure of camptothecin，a novelalkaloidal leukemia and tumor inhibitor from Camptotheca acuminata[J]. J Am Chem Soc，1966，88（16）：3 888
[2]Hsiang YH，Hertzberg R，Hecht S，et al. Camptothecin induces protein-linked DNA breaks via mammalian DNA topoisomerase Ⅰ[J]. J Biol Chem，1985，260（27）：14 873
[3]马锦星，孙仲葆，彭才勤，等.高效液相色谱法测定羟基喜树碱及喜树碱含量[J].中国药房，2001，12（3）：172
[4]Zhao YX，Gao JQ，Qiao HL，et al. Development and validation of a sensitive reversed-phase HPLC method to determine intracellular accumulation of hydroxycamptothecin[J]. J Pharm Biomed Anal，2006，41（3）：1 007
[5]Pu X，Sun J，Wang Y，et al. Development of a chemically stable 10-hydroxycamptothecin nanosuspensions[J]. Int J Pharm，2009，379（1）：167