关于曲美他嗪对糖尿病心肌病变大鼠MMP-9、TIMP-1与TGF-β1 蛋白表达的影响

【摘 要】 目的 探讨曲美他嗪对糖尿病(DM)大鼠心肌纤维化的影响。方法 SD大鼠50只，随机分为对照组（NC），糖尿病心肌病组(DCM)，曲美他嗪治疗组(QMTQ)。免疫组化法、Western印迹技术检测转化生长因子TGF-β1、基质金属蛋白酶(MMP)-9及组织型基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP)-l蛋白表达及含量。结果 与NC组相比，DCM组中MMP-9、TIMP-1及TGF-β1蛋白表达及含量均明显升高．MMP-9／TIMP-l比值降低。QMTQ组上述异常均明显减轻。结论 MMP-9、TIMP-l 及TGF-β1三者平衡失调可能是使DM心肌纤维化发生的机制之一，曲美他嗪可能是通过下调TGF-β1表达，升高MMP-9/TIMP-1比值，保持心肌间质胶原合成和降解的动态平衡，而抑制糖尿病心肌纤维化的发生。
【关键词】 曲美他嗪；糖尿病心肌纤维化；转化生长因子；基质金属蛋白酶
　　DCM作为DM的一种独特的心脏并发症已得到公认，其主要病理改变为心肌细胞肥大、凋亡和心脏间质纤维化(MF)，其纤维化的发生机制不完全清楚。基质金属蛋白酶/基质金属蛋白酶抑制物（MMPS/TIMPS）共同构成体内调节细胞外基质动态平衡的最重要的系统，参与了多种原因所致的心脏间质纤维化过程[1]。曲美他嗪作为改善心肌细胞能量代谢药物已在临床中已广泛应用，但其对糖尿病心肌纤维化的研究报道较少。本试验予曲美他嗪对DM大鼠MF的影响，探讨MMP-9/TIMP-1及TGF-β1 在DCM发生过程中的作用，为临床DCM的治疗提供参考。
　　1 对象和方法
　　1.1 对象
　　 选2 月龄健康雄性SD大鼠（180～200 g）50 只（由辽宁医学院实验动物中心提供）；链脲佐菌素（STZ）（购自美国Sigma公司）；曲美他嗪（武汉福达医药化工有限公司）；MedLab生物信号采集处理系统(南京美易公司)；TUNEL试剂盒（购自北京博奥森生物技术有限公司）；P53、Bax、Bcl-2兔抗小鼠单克隆抗体（购自北京中杉金桥生物有限公司）。
　　1.2 模型与分组
　　 健康雄性SD大鼠50 只，随机分出10 只作为正常对照组（NC），其余以45 mg·Kg-1一次性尾静脉注射1%STZ溶液，正常对照组注入等量容积上述缓冲液。注射后72 h采尾静脉血测血糖，血糖浓度大于16.7 mmol·L-1者为糖尿病大鼠模型。糖尿病模型形成后，普通饲料喂食6 周，随机抽取大鼠10 只，取心肌组织观察微细结构，糖尿病心肌病变模型形成标准为：心肌肌原纤维排列紊乱，局部断裂明显，肌丝成分减少，间质胶原纤维增生；心肌内微血管内皮细胞明显肿胀，核染色质边集，基底膜出现不规则明显增厚，微血管瘤形成；线粒体肿胀变形、嵴稀疏，排列紊乱，结构不清。按随机数字表方法将糖尿病大鼠随机分为两组：糖尿病心肌病组(DCM)，曲美他嗪(QMTQ)治疗组。最终用于实验的动物为对照组10 只，模型组10只，治疗组10 只。糖尿病大鼠心肌病变模型制备成功后开始给药，持续6 周。治疗组给予曲美他嗪10 mg·kg-1，每天灌胃一次，给药容量为10 ml·Kg-1，NC组和DCM组给予等容量纯净水。
　　1.3 指标测定
　　1.3.1 免疫组化检测测定MMP-9、TIMP-1、TGF-β1蛋白表达水平
　　 石蜡切片放入恒温水浴槽烤片2 h，常规酒精从低到高浓度脱蜡至水，置入3%h3O2中灭活内源性过氧化物酶。将切片浸入含0.01 M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）的高压锅内，盖上压力阀至喷气后持续2～3 min抗原修复，自然冷却后PBS（pH7.2～7.6）洗涤。滴加5%BSA封闭液，室温20 min，滴加1:100稀释MMP-9、TIMP-1、 TGF-β1兔抗鼠单抗，4 ℃过夜。PBS洗涤后滴加生物素化山羊抗兔IgG，室温20 min，PBS洗2 min×3 次。滴加SP复合物，室温20 min，PBS洗2 min×4 次。DAB显色，蒸馏水洗涤，苏木素轻度复染，逐级酒精脱水，透明，封片。光镜下观察摄片，每张切片于左上、左下、右上、右下及中部随机取5 个高倍视野（×400）测量灰度值，将每张切片平均灰度值作为该切片的灰度值。
　　1.3.2 Western-blot法检测MMP-9、TIMP-1、TGF-β1蛋白含量
　　 心肌组织匀浆取上清液，提取蛋白样品，按秩序加入泳道进行SDS．PAGE，转膜，抗体孵育，碱性磷酸酶显色。检测免疫复合物，利用凝胶自动分析软件，以β-actin作为内参，对蛋白条带进行分析得出数据文件。
　　1.4 统计学分析
　　 统计学分析应用SPSS16.0统计软件进行处理。实验数据采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较用单因素方差分析，两两比较用q检验。P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有显著统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 大鼠的一般情况
　　 实验期间NC组大鼠精神状况良好，反应灵敏；DCM组大鼠明显消瘦，精神萎靡，因感染或糖尿病加重死亡5 只；治疗组因麻醉过重死亡3 只，治疗期间死亡2 只，与DCM组相比，精神状态尚可，无失明发生。DCM组大鼠体重明显降低，QMTQ组与DCM组相比，体重显著增加。
　　2.2 大鼠心肌组织MMP-9、TIMP-1、TGF-β1蛋白表达
　　2.2.1 免疫组化法（灰度值测定）
　　 与NC组相比，DCM组和QMTQ组MMP-9、TIMP-1、TGF-β1三者蛋白表达灰度值均显著降低（即含量显著增高，P﹤0.01），MMP-9/TIMP-1灰度值比值显著升高（即含量比值显著降低，P﹤0.01）；与DCM组相比，QMTQ组MMP-9、TGF-β1蛋白阳性表达灰度值增高（即含量降低，P﹤0.05），TIMP-1蛋白阳性表达灰度值显著增高（即含量显著降低，P﹤0.01），MMP-9/TIMP-1灰度值比值显著降低（即含量比值显著升高，P﹤0.01）（表1，表2）。
　　表1 三组大鼠心肌TGF-β1、MMP-9、TIMP-1蛋白灰度值比较（±s）　　
组别nTGF-β1MMP-9TIMP-1　　
NC组
DCM组
QMTQ组10
10
10115.74±11.63
95.48±9.21*
106.26±5.18*▲121.29±6.76
104.83±8.25*
110.92±9.94*▲121.42±9.20　　
85.97±10.03*　　
100.93±10.83*﹟
注：与NC组比较，*P＜0.01；与DCM组比较，▲P＜0.05，﹟P＜0.01
表2 三组大鼠心肌MMP-9/TIMP-1灰度值比值比较（±s）　　
组别nMMP-9/TIMP-1　　
NC组
DCM组
QMTQ组10
10
101.02±0.03　　
1.31±0.06*　　
1.18±0.02*﹟　　
　　注：与NC组比较，*P＜0.01；与糖尿病组比较，﹟P＜0.01 转贴于 　　2.2.2 Western-blot检测法
　　与NC组相比，DCM组和QMTQ组MMP-9、TIMP-1、TGF-β1表达均明显增高（P﹤0.01），MMP-9/TIMP-1比值显著降低（P﹤0.01）；与DCM组相比，QMTQ组MMP-9、TGF-β1表达降低（P﹤0.05），TIMP-1表达显著降低（P﹤0.01），MMP-9/TIMP-1比值显著升高（P﹤0.01）（表3，表4）。
　　表3 三组大鼠心肌TGF-β1、MMP-9、TIMP-1蛋白表达比较（±s）(Western-blot)
组别nTGF-β1MMP-9TIMP-1　　
NC组
DCM组
QMTQ组10
10
100.39±0.02
0.89±0.03*
0.83±0.04*▲0.48±0.05
0.81±0.03*
0.79±0.05*▲0.52±0.032　　
1.15±0.O1*
1.03±0.06*﹟
注：与NC组比较，*P＜0.01；与DCM组比较，▲P＜0.05，﹟P＜0.01
　　表4 三组大鼠心肌MMP-9/TIMP-1比值比较（±s）(Western-blot)
组别nMMP-9/TIMP-1　　
NC组
DCM组
QMTQ组10
10
100.93±0.04　　
0.70±0.05*　　
0.79±0.03*﹟　　
注：与NC组比较，*P＜0.01；与DCM组比较，﹟P＜0.01
　　3 讨论
　　 糖尿病心肌病变的病理学特征包括心脏间质纤维化，这种变化的主要组织学基础是心肌间质胶原网络的增生性重建及胶原的积聚。心肌间质胶原合成和降解动态平衡的破坏是MF形成过程的一个重要环节[2]。MMPs是心肌间质纤维胶原降解过程中的最重要的一组包含锌离子的内源性蛋白水解酶类，可以裂解细胞外基质成分并影响其重建，对维持ECM成分的合成与降解发挥重要作用[3]。其中MMP-9又称明胶酶，主要水解变性胶原。TIMPs家族是一个多基因家族的编码蛋白，是MMPs的天然的特异性抑制剂，其中TIMP-1可以与MMP-9的活性部位结合形成1：1复合体，阻止MMP-9与其底物的相互作用。Cheng等[4]的研究表明，在亮氨酸拉链基元区激酶(ZAK)诱导MF的过程中，TIMP-l的活性升高可以下调MMP-9的活性。Daoud等[5]用糖基化终末产物对成年雄性Wistar大鼠心脏成纤维细胞进行培养，发现MMP-9的表达明显升高，TIMP-1轻度升高。王绵等[6]在研究2型糖尿病(T2DM)大鼠心肌MMP-9及TIMP-1的试验中指出，在DM大鼠MF过程中，大鼠心肌胶原纤维明显增多，而MMP-9 mRNA表达及蛋白水平升高，TIMP-1 mRNA表达及蛋白水平也升高，但MMP-9／TIMP-1的比值下降。与本实验结果一致。这表明，明显升高的TIMP-1与MMP-9组成MMP-9／TIMP-1复合物，使MMP-9降解胶原的作用受到抑制，导致DM组大鼠心肌胶原蛋白过度沉积，引起MF。
　　 在许多器官系统中，TGF-β1是间质成分形成及纤维细胞增生的有效诱导剂，是胶原合成的强有力的启动因子。高俊杰等[7]的研究表明，糖尿病大鼠心肌组织中Ⅲ型胶原的变化水平与TGF-β1在心肌组织的表达水平呈正相关，说明TGF-β1可能调控Ⅲ型胶原蛋白的表达。Ziyadeh FN等[8]证实TGF-β1是与胶原代谢关系最密切的细胞因子，是重要的促纤维化生长因子，其在心肌组织的过度表达，可使细胞外基质成分过度沉积。Kanno Y[9]等提出TGF-β1表达增加可促进成纤维细胞分化增生，上调胶原合成，参与心肌纤维化的发生。本研究显示，与NC组比较，12 周末糖尿病大鼠心肌组织中TGF-β1表达水平明显增加，与上述结果一致。与DCM组比较，QMTQ组大鼠心肌组织中TGF-β1表达水平降低，说明曲美他嗪可能通过下调TGF-β1的表达水平发挥抑制心肌纤维化的作用，关键在于使细胞外基质中主要成分-胶原的合成与降解趋于稳态。
　　 综上所述，MMP-9、TIMP-1与TGF-β1均是MF的重要调控因素。曲美他嗪是一种优化心肌能量代谢的抗心肌缺血药物。主要是通过选择抑制性线粒体长链3-酮酰基辅酶A硫解酶的作用，促进葡萄糖氧化，产生更多的ATP，提高氧的利用率。在心肌代谢障碍的情况下，葡萄糖裂解ATP的再合成中需要的氧减少，因此能够改善心肌的能量代谢，提高对低氧应激的耐受能力，抑制氧自由基的产生，从而保护了心肌细胞[10]。本实验应用曲美他嗪对糖尿病大鼠心肌纤维化进行干预，结果表明其可降低MMP-9、TIMP-1与TGF-β1蛋白表达，MMP-9/TIMP-1升高比值。由此可见，曲美他嗪调节MMP-9、TIMP-1以及MMP-9/TIMP-1三者的平衡，维持细胞外基质胶原降解与合成之间的稳态，抑制糖尿病心肌纤维化的发生发展。但其作用机制还有待于进一步观察和研究。
参考文献
[1] 杨青华，勾英.2型糖尿病大鼠心脏MMP-2、MMP9、TIMP-1、TIMP-2的变化与糖尿病心肌病变关系[J].中国医学创新，2010，6(7):12-13.
[2] Berk BC， Fujiwara K， Lehoux S. ECM remodeling in hypertensive heart disease[J]. J Clin Invest，2007，117(3): 568-75.
[3] 荆文，尹苗，杜会芹，等．ApoE基因缺失幼龄小鼠动脉粥样硬化12相关基因的时序表达研究[J]．生物化学与生物物理进展，2008，35(2):217-23.
[4] Cheng YC，Kuo WW，Wu HC，et al．ZAK induces MMP-2 activity via JNK／p38 signals and reduces MMP-9 activity by increasing TIMP-1／2 expression in H9c2 eardiomyo blaat ceHs[J].Mol Cell Biochem，2009，325(1-2):69-77.
[5] Daoud S，Schinzel R，Neumann A，et al ，Advanced glycation endproducts：activators of cardiac remodeling in primarv fibroblasts from aduh rat hearts[J].Molecular Med，2001，7 (8):543-51.
[6] 王绵，张力辉，邓永贵．2型糖尿病大鼠心肌组织MMP-2、MMP-9、TIMP-l的表达与胶原代谢的关系[J].中国糖尿病杂志，2006，14(2):133-6.
[7] 高俊杰，潘晓黎，吴伟，等.转换生长因子β1和胶原蛋白与糖尿病心肌纤维化的实验研究[J].中国老年学杂志，2006，26:505-507.
[8] Ziyadeh FN， Wolf G. Pathogenesis of the podocytopathy and proteinuria in diabetic glomerulopathy[J]. Curr Diabe tes Rev， 2008， 4(1):39-45.
[9] Kanno Y， Into T， Lowenstein CJ， et al. Nitric oxide regul ates vascular calcification by interfering with TGF-signal ling[J]. Cardiovasc Res，2008，77(1):221-230.
[10] Fioalaliso F，Bianchi R，Staszeawsky L， et a1．Antioxidant treatment attentlaleo hyperglycemia in duced cardiomy ocyte death in rats[J].J Mol Cell Cardiol，2004，37(5):959- 968．