关于吲哚胺2，3双加氧酶在子痫前期病人胎盘组织表达

【摘要】 目的 探讨吲哚胺2，3双加氧酶(IDO)在胎盘组织表达与子痫前期发病的关系。方法 采用免疫组化法分别检测30例轻度子痫前期病人、30例重度子痫前期病人和38例正常晚孕妇女胎盘组织IDO蛋白表达，并采用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统分析各组图片IDO阳性细胞的平均吸光度值;RTPCR法检测各组孕产妇胎盘组织IDO mRNA的表达水平;彩色超声多普勒检测各组孕妇胎儿脐动脉血流阻力指数(RI)，并分别测量各组新生儿出生体质量。结果 各组孕产妇胎盘组织均有IDO蛋白表达，且主要表达于胎盘合体滋养细胞的胞质中，胎盘间质细胞及血管内皮细胞胞质中也可见少量表达。轻度子痫前期组及重度子痫前期组孕产妇胎盘组织IDO阳性细胞平均吸光度明显高于正常晚孕组，差异有显著性(F=462.895，q=3.474、11.002，P&<0.01);重度子痫前期组高于轻度子痫前期组，差异有统计学意义(q=22.491，P&<0.01)。轻度及重度子痫前期组胎盘组织IDO mRNA表达水平较正常晚孕组显著降低，差异均有统计学意义(F=90.032，q=8.457、16.913，P&<0.01);且重度子痫前期组胎盘组织IDO mRNA表达水平明显低于轻度子痫前期组，差异有统计学意义(q=8.000，P&<0.01)。子痫前期组孕产妇胎盘组织IDO mRNA表达水平与其胎儿脐动脉RI呈负相关(r=-0.445，P&<0.01)，与其新生儿出生体质量呈正相关(r=0.449，P&<0.01)。结论 子痫前期病人胎盘组织IDO表达下降可能是子痫前期发病的原因之一。

【关键词】 子痫;吲哚胺2，3双加氧酶;免疫耐受;妊娠;胎盘

[ABSTRACT] Objective To investigate the expression of indoleamine 2，3dioxygenase (IDO) in placenta and its relationship with preeclamptic morbidity. Methods By using immunohistochemical technique， the expression of IDO in placenta was detected in 30 patients with mild， 30 with severe preeclampsia (PE) and 38 normal late pregnancies. The average optical density (AOD) of IDO positive cells in each picture was valued by Motic Med 6.0.analysis system. Semiquantitative RTPCR was used to investigate the expression of IDO mRNA in placenta of each group. The index of resistance of blood flow of umbilical artery wasevaluated by multicolor ultrasound Doppler， the birth weight of all the infants recorded. Results IDO protein was expressed in the placenta， mainly in syncytiotrophoblast， of all the three groups， small amounts of IDO could be seen in vascular endothelial and interstitial cells. The AOD of IDO in the mild PE and severe PE groups was significantly higher than that in the normal control， the differences being significant (F=462.895;q=3.474，11.002;P&<0.01)， and that in the severe PE was higher than that in the mild PE， with statistical difference (F=462.895，q=22.491，P&<0.01). The levels of IDO mRNA expression in both the mild and severe PE were lower than that in the normal control group (F=90.032;q=8.457，16.913;P&<0.01)， and the expression in the severe PE group was lower than that in the mild (q=8.000，P&<0.01). In PE groups， the expression levels of IDO mRNA in placenta were negatively correlated with the RI (r=-0.445，P&<0.01)， and positively correlated with birth weight of the newborns (r=0.449，P&<0.01). Conclusion Decrease of IDO expression in placenta in preeclamptic patients might be one of the reasons for the onset of this disease.

　　[KEY WORDS] eclampsia; indoleamine 2，3dioxygenase; immune tolerance; pregnancy; placenta

　　子痫前期是妊娠期特有疾病，严重者可造成多器官损伤，威胁母婴的生命安全，是目前围生期孕妇和围生儿死亡的主要原因。该病的发病机制至今尚不明确，血管内皮损伤、氧化应激和母胎免疫耐受平衡失调是目前较公认的发病原因之一[1]。吲哚胺2，3双加氧酶(IDO)是肝外组织催化色氨酸(Trp)沿犬尿酸途径分解代谢的第一限速酶，其广泛表达于母胎界面，在抗炎及诱导母胎免疫耐受[2]中发挥着重要的调节作用。近年来相关研究表明，IDO可能参与子痫前期的发病机制。本文通过检测正常晚孕妇女及子痫前期病人胎盘组织中的IDO表达，以探讨其在子痫前期病人发病过程中的作用，现将结果报告如下。

　　1 资料与方法

　　1.1 研究对象

　　2008年7月—2009年8月，选取在河北省沧州市中心医院产一科住院分娩的子痫前期病人60例，其中轻度子痫前期病人30例(轻度子痫前期组)，平均年龄(29.0±5.4)岁，平均孕周(37.1±0.6)周，体质量指数(BMI)为(30.2±3.4)kg/m2，平均新生儿出生体质量(3 262±595)g，平均脐动脉血流阻力指数(RI)为0.55±0.05;重度子痫前期病人30例(重度子痫前期组)，平均年龄(28.8±4.9)岁，平均孕周(36.8±1.1)周，BMI为(30.6±4.1)kg/m2，平均新生儿出生体质量(2 504±620)g，平均脐动脉RI为0.59±0.09。子痫前期诊断参照文献[3]标准。以同期分娩的健康晚孕妇女38例为对照组，平均年龄(26.7±4.1)岁，平均孕周(37.3±0.5)周，BMI为28.9±3.5 kg/m2，平均新生儿出生体质量(3 480±306)g，平均脐动脉RI为0.54±0.04。3组孕妇均为首次妊娠，单胎，且各组孕妇年龄、孕周、BMI无显著差异(P&>0.05)，均除外其他内外科并发症，无烟酒等不良嗜好。3组孕妇均在连续硬膜外麻醉下行剖宫产术结束分娩。

　　1.2 标本处理

　　于胎盘娩出后30 min内，立即在无菌状态下于胎盘母体面中央位置(避开坏死及钙化区)取两块约1 cm×1 cm×1 cm大小胎盘组织，于灭菌生理盐水中反复漂净后，无菌纱布吸掉水分，其中一块放于1.5 mL的无菌离心管中，15 min内置于-70 ℃冰箱保存，用于RNA提取;另一块新鲜胎盘组织置于40 g/L多聚甲醛中固定24 h后，常规石蜡包埋切片用于免疫组化测定。

　　1.3 主要试剂及仪器

　　免疫组化SABC试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司;小鼠抗人IDO单克隆抗体为美国RND公司产品;总RNA极速抽提试剂盒，购自上海飞捷生物技术有限公司;RTPCR试剂盒(两步法)为杭州博日科技有限公司产品;IDO及内参照引物均由上海生工公司合成。

　　基因扩增仪TCXPG为杭州博日科技有限公司生产;LEICA DM 2000型倒置显微镜成像系统(德国);数码医学分析系统Motic Med 6.0(麦克奥迪公司);GIS 1D(Ver.4.0)图像分析软件(上海天能公司)。

　　1.4 方法

　　1.4.1 免疫组化SABC法检测IDO蛋白在胎盘组织中的定位 染色步骤按照试剂盒说明操作，IDO工作浓度为1∶100，以0.1 mol/L的PBS作阴性对照。采用LEICA DM 2000型倒置显微镜成像系统拍摄各组图片，并采用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统分析各组图片IDO阳性细胞的平均吸光度值(A值)，以其作为IDO的表达强度。

　　1.4.2 RTPCR方法检测胎盘组织IDO mRNA的表达 提取胎盘组织总RNA，严格按照试剂盒说明书操作。基因序列查自GenBank，应用专业引物软件Primer Premier 5.0设计，由上海生工公司合成。IDO上游引物序列：5′TTTGCTAAAGGCGCTGTTGG3′，下游引物序列：5′CCTTCATACACCAGACCGTCTGA3′，扩增产物长度为168 bp;内参照GADPH上游引物序列：5′TCATGGGTGTGAACCATGAGAA3′，下游引物序列：5′GGCATGGACTGTGGTCATGAG3′，扩增产物的长度146 bp。扩增条件：94 ℃预变性5 min，然后94 ℃ 30 s，51 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共32个循环;72 ℃延伸5 min;4 ℃ 5 min。取5 μL反应产物，用15 g/L琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结果用计算机扫描分析，以各组标本IDO与GAPDH扩增条带的实际灰度值的比值表示IDO mRNA的表达水平。

　　1.5 统计学处理

　　采用SPSS 11.5及PPMS 1.5[4]统计学软件进行数据处理，结果以±s表示，组间比较采用方差分析，相关关系采用直线相关分析，P&<0.01为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 各组孕产妇胎盘组织IDO蛋白定位

　　各组孕产妇胎盘组织中均有IDO蛋白表达，主要表达于胎盘滋养层细胞，以合体滋养细胞的胞质表达为主，胎盘间质细胞和血管内皮细胞也可见少量表达。

　　2.2 各组孕产妇胎盘组织IDO阳性细胞平均吸光度及IDO mRNA表达水平的比较

　　轻度子痫前期组、重度子痫前期组孕产妇胎盘组织中IDO阳性细胞的平均吸光度均明显高于正常晚孕组，差异均有统计学意义(F=462.895，q=3.474、11.002，P&<0.01);重度子痫前期组明显高于轻度子痫前期组，差异有统计学意义(q=22.491，P&<0.01)。轻度子痫前期组及重度子痫前期组胎盘组织中IDO mRNA表达水平均明显低于正常晚孕组(F=90.032，q=8.457、16.913，P&<0.01)，重度子痫前期组明显低于轻度子痫前期组，差异有统计学意义(q=8.000，P&<0.01)。见表1，图1、2。表1 各组孕产妇胎盘组织IDO阳性细胞平均吸光度及IDO mRNA表达比较

　　2.3 各组孕妇胎儿脐动脉RI及新生儿出生体质量比较

　　重度子痫前期组孕妇胎儿脐动脉RI均明显高于正常晚孕组和轻度子痫前期组，差异有统计学意义(F=7.804，q=4.578、3.464，P&<0.01);而正常晚孕组与轻度子痫前期组相比，差异无统计学意义(q=0.916，P&>0.05)。重度子痫前期组新生儿出生体质量明显低于正常晚孕组和轻度子痫前期组，差异有统计学意义(F=32.281，q=11.047、8.115，P&<0.01);而正常晚孕组与轻度子痫前期组新生儿出生体质量比较，差异无统计学意义(q=2.467，P&>0.05)，见表2。

　　表2 各组孕妇胎儿脐动脉RI及新生儿出生体质量比较(±s)组 别nRI新生儿出生体质量(m/g)正常晚孕组380.54±0.043 480±306轻度子痫前期组300.55±0.053 262±595重度子痫前期组300.59±0.092 504±620

　　2.4 子痫前期组孕产妇胎盘组织IDO mRNA表达与胎儿脐动脉RI及新生儿出生体质量的相关性

　　子痫前期组孕产妇胎盘组织IDO mRNA表达水平与其胎儿脐动脉RI呈负相关(r=-0.445，P&<0.01)，而与其新生儿出生体质量呈正相关(r=0.449，P&<0.01)。

　　3 讨 论

　　IDO是一种含亚铁血红素的单体蛋白，由403个氨基酸组成，相对分子质量42 000，是肝脏以外惟一可以催化Trp沿犬尿酸途径分解代谢的限速酶，广泛分布于人和其他哺乳类动物肝外组织中，在胎盘、肺和肠道等组织中该酶活性相对较高。IDO主要由外周血单核、巨噬细胞和胎盘滋养细胞分泌，是一种胞质酶，以超氧阴离子作为辅助因子降解Trp中的吡咯环，最适作用底物为LTrp。

Trp是细胞维持活化和增殖所必需的氨基酸，同时也是构成蛋白质必不可少的重要成分，参与机体多种病理生理过程。IDO可通过降低局部微环境Trp含量来抑制T细胞的活化和增殖[5]，同时其降解产物犬尿酸也可产生细胞毒作用，诱导细胞调亡。多项研究结果显示，γ干扰素(γIFN)是最强的IDO激活物[6]，可通过位于5′端的调节区域影响IDO基因的表达。IDO具有多种生物学特性，参与机体多种病理生理过程，在抗氧自由基、抗炎、抗感染[7]和免疫耐受调节过程中发挥着重要的作用。移植免疫的相关研究证明，IDO表达升高能够减弱局部T细胞介导的急性免疫排斥反应，诱导移植免疫耐受[8]，延长移植物的存活时间。而在肿瘤治疗学领域的研究中却显示，IDO的这一免疫保护机制却成了肿瘤细胞免遭人体免疫系统攻击的原因之一[9]。同时，FRIBERG等[10]在克服肿瘤免疫耐受的研究中显示，使用IDO的竞争性抑制剂1甲基色氨酸(1MT)后，可逆转这种免疫逃逸作用。表明IDO的表达参与了机体局部的免疫耐受反应。而妊娠是最成功的同种异体移植范例，对发生早期流产病人母胎界面的研究显示，　一旦IDO抑制物大量存在，对胎儿的异体识别则可导致补体活化、炎症及胎儿丢失[2]。因此推测，IDO的正常表达是维持妊娠的必要保障。

　　有关子痫前期的发病机制目前尚无定论。近年来研究表明，血管内皮损伤、氧化应激及母胎免疫耐受失衡是重要的原因之一，其中系统性的炎症反应是子痫前期发病的中心环节[11]，母胎界面是导致子痫前期发病的关键部位。IDO的表达与流产的关系密切，其在母胎界面的表达和活性降低可导致母体对胎儿产生排斥而引起流产[2]，而子痫前期具有与流产相类似的免疫机制。国外的相关研究表明，正常妊娠孕妇体内IDO mRNA表达水平明显高于子痫前期病人[12]。NISHIZAWA等[13]报道，给正常妊娠小鼠注射IDO抑制剂后，出现了类似子痫前期的表现。因此推测，IDO的表达变化可能与子痫前期的发病有关。

　　目前关于IDO在胎盘组织中的定位报道不一，且国内对IDO mRNA在子痫前期病人胎盘中的表达报道较少。本研究结果显示，IDO蛋白主要表达于滋养层细胞，以合体滋养细胞胞质中表达为主，胎盘间质细胞和血管内皮细胞也可见少量表达;正常晚孕组孕产妇胎盘组织中IDO mRNA表达明显高于子痫前期组，而且随子痫前期病人病情的加重，IDO mRNA表达呈下降趋势，提示IDO与子痫前期的发病有关。但其表达降低的机制尚不明确，考虑为子痫前期病人IDO的消耗大于其生成所致，推测与子痫前期的氧化应激[14]及过度炎症反应[15]等因素有关。许多研究已经证实，子痫前期病人脂质代谢异常，体内氧自由基含量增多，而氧化应激和氧自由基增加是导致血管内皮进一步受损的重要机制;同时，氧自由基的增加可刺激母胎界面IDO大量消耗，损害了机体的免疫保护机制，使母胎免疫耐受平衡失调，胎盘滋养细胞凋亡增加，浸润能力下降，导致胎盘浅着床缺血低氧，从而引发子痫前期及低体质量儿的出现。本研究结果表明，子痫前期病人胎盘组织IDO mRNA表达水平与其孕妇胎儿脐动脉RI呈负相关，与其新生儿出生体质量呈正相关，也支持了这一点。

　　综上所述，孕妇胎盘组织IDO的正常表达是妊娠得以维持的必要保障，其表达减少可能参与了子痫前期的发病过程，但子痫前期病人胎盘组织IDO表达降低的具体机制还有待进一步的研究。目前，有关IDO活性诱导剂的研究已经成为热点内容，深入探讨IDO的调控机制对于明确子痫前期的发病机制以及研究有效治疗药物具有重要的临床意义。

【

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