关于禁食前后小鼠胃黏膜NUCB2的变化

　　　　　　 作者：李清春 管洪在 陈曦 蒋正尧

【摘要】 目的 观察禁食前后小鼠胃黏膜NUCB2表达的变化。方法 取正常饮食小鼠和禁食48 h的小鼠胃体黏膜组织，采用逆转录PCR检测NUCB2 mRNA表达的变化，Western blot方法检测NUCB2蛋白表达的变化。结果 与正常饮食小鼠比较，禁食48 h后小鼠胃黏膜NUCB2 mRNA水平无明显变化，但其蛋白质表达明显下降(t=9.59，P&<0.01)。结论 禁食48 h后小鼠NUCB2蛋白的变化是在翻译或翻译后水平上发生。
【关键词】 禁食;NUCB2;逆转录聚合酶链反应;免疫印迹法;小鼠
[ABSTRACT] Objective To observe the changes of NUCB2 in gastric mucosa in mice before and after fasting. MethodsThe gastric mucosa in mice with normal diet and that after fasting for 48 h were taken for detection of mRNA expression of NUCB2 by PCR， and NUCB2 protein by Western blot. Results The levels of the mRNA expression of NUCB2 were not significantly different between fasting and normaldiet groups， but the protein expression of NUCB2 was significantly decreased in fasting group (t=9.59，P&<0.01). Conclusion The changes of NUCB2 protein after fasting 48 h were taken place in translation or posttranslation level.
　　[KEY WORDS] fasting; NUCB2; reverse transcriptase polymerase chain reaction; immunoblotting; mice
　　nesfatin1是由日本科学家森昌朋等新发现的一种摄食调节肽[1]，其前体(NUCB2)是NEFA基因编码的由420个氨基酸组成的多肽，NUCB2上有与DNA和Ca2+结合的位点。在转换酶的作用下NUCB2裂解，将其N末端82个氨基酸片段称之为nesfatin1，C末端的两个片段分别称之为nesfatin2、nesfatin3。nesfatin1能够以非饱和的方式通过血脑脊液屏障[23]，大鼠脑脊液中含有nesfatin1。大鼠禁食24 h后，室旁核NUCB2 mRNA表达显著减少[1]，而CFos免疫组化分析表明，禁食后再进食能激活室旁核nesfatin1神经元[4]。一般情况下，脑中的肽在胃肠道中亦有表达，本实验旨在观察小鼠禁食前后胃体黏膜组织中NUCB2表达的变化，以探讨其在摄食调节方面的作用。
　　1 材料和方法
　　1.1 动物分组及处理
　　健康昆明种小白鼠24只，清洁级，雌雄各半，体质量18～22 g，由青岛市药检局提供。随机分为正常饮食组12只，禁食48 h组12只。正常饮食组小鼠自由进食、饮水，自然昼夜节律光照。禁食48 h组小鼠，禁食期间自由饮水，将食物撤走。48 h后将两组小鼠脱臼处死，快速取小鼠胃体组织，分为两部分，一部分用加焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的生理盐水冲洗，一部分用生理盐水冲洗后分别装至EP管中，液氮速冻，24 h后转移至-80 ℃冰箱冻存，以备NUCB2的mRNA提取和免疫印迹实验。
　　1.2 RNA提取及逆转录PCR
　　用Trizol Reagent(美国Invitrogen公司)常规方法从50 mg胃体黏膜组织中提取总RNA，Eppendorf紫外线分光光度计测定RNA浓度和纯度，并行8 g/L琼脂糖凝胶电泳，观察RNA完整性。取5 μg总RNA，以Oligo dT为引物，按说明书进行逆转录反应得到cDNA备用[5]。PCR反应以βactin作为内参照。βactin上游引物序列为5′CTGGGACGACATGGAGAAAA3′，下游引物序列为5′AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC3′(564 bp);NUCB2上游引物序列为5′CGGAAGCAAAGATCAACTA3′，下游引物序列为5′TTCCTCCAGAGTCACCAAT3′(283 bp)。所用引物由上海生工生物工程技术服务公司设计并合成。PCR反应体系为25 μL，含Taq酶 0.125 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL　dNTP Mixture 2 μL，上下游引物各0.5 μL， 模板cDNA1 μL，加入灭菌双蒸水至25 μL。反应条件如下：95 ℃预变性5 min;94 ℃ 变性 30 s，57 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸 30 s，共35个循环;最后72 ℃ 延伸10 min。取5 μL的PCR产物在15 g/L琼脂糖凝胶上电泳，用天能凝胶成像系统照相。NUCB2mRNA表达水平用目的条带吸光度值与βactin 条带吸光度值之比表示。
　　1.3 Western blot方法测定小鼠胃黏膜NUCB2蛋白表达
　　冷冻保存的胃体黏膜组织取出后在三重细胞裂解液中匀浆，4 ℃静置2 h，4 ℃离心(12 000 r/min) 10 min，取上清液。用BioRad试剂盒进行蛋白质定量，将蛋白质含量调一致后加上样缓冲液，100 ℃变性5 min，总蛋白上样量为20 μg，置于100 g/L SDSPAGE凝胶上电泳100 min，转至硝酸纤维膜上。用含体积分数0.05脱脂奶粉的洗脱缓冲液(TBS)封闭后，加兔抗鼠nesfatin1一抗(1∶5 000，凤凰制药公司，美国)、兔抗鼠βactin一抗(1∶1 000， 博奥森公司， 中国)孵育2 h;加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(1∶1 000，圣克鲁斯公司，美国)孵育1 h。最后与ECL显影剂反应，曝光，显影，用扫描仪收集图像，用天能凝胶成像系统照相。NUCB2蛋白表达水平用目的蛋白条带吸光度值与βactin 条带吸光度值之比表示。
　　1.4 统计学处理
　　采用SPSS 16.0软件处理系统进行统计学分析。实验数据以±s表示，组间比较采用t检验，以P&<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结 果
　　2.1 小鼠胃体黏膜组织NUCB2 mRNA表达水平
　　禁食48 h组小鼠胃体黏膜组织NUCB2与βactin mRNA表达的比值为0.18±0.03，正常饮食组为0.19±0.04，两组比较差异无显著意义(P&>0.05)。见图1。
　　2.2 小鼠胃体黏膜组织NUCB2蛋白表达水平
　　禁食48 h组小鼠胃体黏膜组织NUCB2与βactin蛋白表达的比值为1.39±0.15，正常饮食组为2.37±0.26，两组比较差异有显著性(t=9.59，P&<0.01)。见图2。
　　3 讨 论
　　M：Marker;①禁食48 h组;②正常饮食组。
　　图1 NUCB2 mRNA 在琼脂糖凝胶上的电泳结果
　　①禁食48 h组;②正常饮食组。
　　图2 Western blot方法检测小鼠胃体黏膜NUCB2蛋白表达
　　脑室内注射nesfatin1抑制摄食呈剂量依赖性，而nesfatin2和nesfatin3无此作用[1]。认为在体内NUCB2必须裂解转换为nesfatin1才能发挥其饱感信号分子的作用。脑室内慢性给予nesfatin1具有减少脂肪储存和减小体质量的作用。脑室内给予其抗体Ab24中和内源性nesfatin1，可导致动物的摄食量显著增加。含有nesfatin1的神经元主要分布于下丘脑室旁核、视上核、下丘脑外侧区、弓状核和孤束核，其中以室旁核NUCB2 mRNA表达最高[4，67]。而室旁核、弓状核和下丘脑外侧区均是摄食调控中枢。
　　原位杂交、CFos免疫组化的研究表明，在室旁核和视上核许多表达nesfatin1的神经元同时表达催产素或加压素，饥饿使这一类神经元失活，而被“禁食24～48 h后的再进食”所激活[47]。在弓状核NUCB2 mRNA表达于阿黑皮素原可卡因安非它明转录调节肽(POMC/CART)神经元，而不表达于神经肽Y刺鼠色蛋白相关蛋白(NPY/AgRP)神经元。在大鼠下丘脑外侧区，90%的黑色素浓缩激素(MCH)神经元呈现nesfatin1免疫反应阳性，80%的nesfatin1免疫反应阳性细胞也显示MCH免疫反应阳性[8]。MCH刺激摄食、参与睡眠觉醒的调控，而nesfatin1是一种厌食调节肽，两者共存的意义令人深思。下丘脑外侧区90%的nesfatin1细胞呈现CART免疫反应阳性;而这一脑区的orexin细胞不表达nesfatin1。在所有NUCB2免疫反应阳性的脑区，nesfatin1均和CART免疫反应阳性共存。双标记实验表明，迷走神经背核的nesfatin1神经元呈胆碱乙酰化酶阳性，鉴于迷走神经背核大量的胆碱能神经元支配胃肠道平滑肌，由此推测胆碱能神经元末梢释放的nesfatin1可能具有调节胃肠运动的作用。
　　SHIMIZU等[9]报道，腹腔注射nesfatin1抑制小鼠摄食，分析只有nesfatin1的中间片段(24～53位氨基酸)产生抑制摄食效应。CFos免疫组化进一步的研究表明腹腔注射nesfatin1中间片段，在孤束核观察到CFos免疫阳性细胞，孤束核POMC和CART mRNA表达增加，而下丘脑弓状核神经元并没有被激活。由此认为腹腔注射nesfatin1的摄食抑制效应是通过孤束核促黑激素系统介导的。XU等[10]研究表明，禁食对动眼神经副核的非神经节前的nesfatin1的mRNA及其蛋白质没有影响，表明nesfatin1在食物消耗中的作用比在食物剥夺中的作用强。

　　STENGEL等[1112]的研究结果提示，NUCB2 mRNA也表达于大鼠胃黏膜泌酸腺内分泌细胞，大部分与ghrelin共存于X/A细胞，但各自存在于不同囊泡，少部分与生长抑素或组氨酸脱羧酶共存。而且胃黏膜NUCB2 mRNA的表达比脑组织高十几倍，大鼠禁食24 h后，胃黏膜NUCB2 mRNA的表达显著下调。同时，大鼠在禁食24 h后血浆nesfatin1的水平明显降低，再进食后其血浆水平又升高。本文实验结果表明，小鼠胃体黏膜有NUCB2 mRNA及其蛋白的表达，虽然小鼠在禁食前后胃体黏膜组织中NUCB2 mRNA水平没有发生变化，但其蛋白质水平却在禁食48 h后明显降低，导致血浆中nesfatin1的含量降低，从而发挥其抑制摄食的作用。虽然我们的结果与STENGEL等的结果在mRNA水平上是不同的，但在蛋白质水平上是一致的，这可能与禁食时间的长短、实验动物、实验条件的不同有关，还需要进一步探讨。
　　综上所述，禁食48 h后，小鼠胃体黏膜组织中nesfatin1的前体蛋白NUCB2的mRNA水平没有发生变化，但在蛋白质水平上却显著降低，表明胃内nesfatin1的变化是在翻译或翻译后水平上发生了改变，从而导致血浆中nesfatin1水平降低。
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