关于玻璃粘连蛋白对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化影响

　　　　　　 作者：王明明 叶发刚 葛银林

【摘要】 目的 体外分离纯化培养大鼠骨髓间充质干细胞（rMSC），研究玻璃粘连蛋白（VN）在rMSC向成骨方向分化过程中的作用。方法 贴壁分离培养法分离纯化rMSC，观察第1、3、5、8、10代细胞的增殖情况，并绘制出生长曲线。选第3代细胞用以VN包被的培养板培养，每4 d检测碱性磷酸酶活性及钙结节的形成。结果 经贴壁筛选法分离的rMSC生长曲线呈S形，第3、4、5代细胞排列具有典型的漩涡状结构；细胞表达CD44、CD90，而不表达CD34。用以VN包被的培养板培养12 d，碱性磷酸酶染色呈阳性，硝酸银染色显示有钙结节形成。结论VN有诱导rMSC向成骨方向分化的作用。
【关键词】 骨髓;间质干细胞；玻璃粘连蛋白;细胞分化
　　［ABSTRACT］ Objective To isolate， purify and cultivate the rat mesenehymal stem cells (rMSCs) in vitro， and study the effect of vitronectin (VN) on osteogenic differentiation of rMSCs. Methods rMSCs were isolated and purified by wall adhesion culture procedure in vitro. The growth curve of cell proliferation was obtained based on the observation of the proliferation status of 1st， 3rd， 5th， 8th， and 10th generation. The cells of the 3rd generation were cultured in culture plates coated by VN， and calcifying nodule and alkaline phosphatase (ALP) activity checked every four days. Results The rMSCs growth curve appearred as S form， and 3rd，4th and 5th generation manifested as typical whirlpool structure. These cells expressed CD44 and CD90， but not CD34. The cells cultured for 12 days in cultureplates and coated with VN showed positive ALP expression and calcifying nodules. Conclusion Vitronectin pocesses a potential of inducing RMSC towards osteogenic differentiation.
　　［KEY WORDS］ bone marrow; mesenchymal stem cells; vitronectin; cell differentiation
　　骨髓间充质干细胞（MSC）为骨髓中一群多能干细胞，在不同的因素诱导下可以分化为不同的细胞。启动MSC分化的确切因素尚不十分清楚，周围环境中某些可溶性诱导因子已被成功鉴定，而周围不可溶性成分对成骨诱导的作用相对关注较少。本实验主要研究构成细胞外基质主要成分的玻璃粘连蛋白（VN）在MSC向成骨分化过程中的作用，以探讨MSC成骨分化的确切因素。
　　1 材料和方法
　　1.1 实验材料
　　Wistar大鼠，2月龄，由青岛市药品检验所提供。VN（武汉博士德生物工程有限公司），LDMEM低糖培养基(GIBCO公司)， 胎牛血清(兰州民海生物工程有限公司)，胰蛋白酶(SIGMA公司)，羊抗大鼠CD34FITC、CD44FITC、CD90FITC（北京中山生物公司）。
　　1.2 实验方法
　　1.2.1 大鼠骨髓间充质干细胞（rMSC）的体外分离培养
　　取2月龄Wistar大鼠，颈椎脱臼处死，无菌条件下取出其股骨，用LDMEM冲出骨髓，离心去除上清及脂肪，所得细胞悬液以1.0×108/L的细胞密度接种于75 mL培养瓶中，在含体积分数0.15胎牛血清LDMEM完全培养液中，37 ℃、体积分数0.05 CO2、饱和湿度条件下培养，3 d后首次换液，去除未贴壁细胞。以后每2～3 d换液1次，待贴壁细胞融合90%时，以2.5 g/L胰蛋白酶消化、传代。贴壁细胞融合90%时即传代1次，传至第3代时进行实验。
　　1.2.2 rMSC的生长曲线绘制
　　分别取第1、3、5、8、10代细胞，用2.5 g/L胰蛋白酶消化后加入LDMEM完全培养液，调整细胞密度至1.0×107/L，接种于5个24孔板，每孔加细胞悬液1.0 mL。每天每板取3孔消化，制成细胞悬液，混匀，计数并取平均值，连续9 d，以时间为横坐标，细胞数为纵坐标绘制生长曲线。　　
　　1.2.3 rMSC的鉴定
　　①形态学观察:在倒置显微镜下定期观察细胞生长情况。②细胞表面标志鉴定: 取第3代细胞消化、计数、离心，加入200 μL PBS制成细胞悬液。设置阴性对照，加入羊IgG1FITC;其他管分别加羊抗大鼠CD34FITC、CD44FITC、CD90FITC以及细胞与荧光素共轭抗体抗CD29、CD34、CD90，在黑暗中孵化15 min。流式细胞仪检测细胞表面抗原表达情况。
　　1.2.4 rMSC与VN共培养及相关指标检测
　　在rMSC传代3次后，将指数生长期细胞用LDMEM调细胞的密度为3.0×103/cm2，接种于用纯化的VN包被的24孔培养板中，以成骨诱导液为阳性对照，以含体积分数0.15胎牛血清LDMEM完全培养液为阴性对照，每3 d换液1次，在培养至4、8、12和16 d时分别进行碱性磷酸酶染色和钙离子沉淀测定。碱性磷酸酶染色：向培养板中加入双蒸水配制的萘酚ASMX磷酸盐和Fast blueRR溶液，孵育，显微镜下测定染料沉积情况。钙离子沉淀的测定：用30 g/L的多聚甲醛固定细胞30 min，双蒸水洗2次，暗处与50 g/L的硝酸银溶液孵育10 min，双蒸水洗后暴露于强光下1 h，计数染色细胞沉积颗粒的数目和大小。
　　2 结　　果
　　原代培养细胞12 h可见细胞贴壁， 3 d后大部分细胞贴壁，第1次换液后细胞4 h贴壁，细胞呈多角形、菱形，可见集落形成;9～10 d细胞间相互融合达90%。传代后细胞4 h贴壁，生长迅速，细胞呈较为均一的梭形、多角形，并呈漩涡状排布。 rMSC生长曲线呈S形，第3～5代增殖迅速，1代和8代次之，10代生长明显减慢（图1）。分离纯化的细胞不表达造血细胞表面标志CD34，而强表达CD44、CD90，说明所提取、纯化的细胞是MSC，而不是成纤维细胞或造血干细胞。诱导组第8天细胞碱性磷酸酶染色可见棕黑色颗粒，第12天棕黑色颗粒明显增多增大，提示碱性磷酸酶染色阳性，而阴性对照组无此颗粒。硝酸银染色诱导组呈多量黑色颗粒，而阴性对照组无此颗粒，阳性对照组颗粒更为粗大。

　　3 讨　　论
　　近年来研究表明，MSC是一种具有多向分化潜能的干细胞，特定条件下可向成骨细胞、成软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞等分化［12］。体内多种影响其分化的可溶性因子已被分离鉴定，如MSC在含有维生素C、地塞米松、β磷酸甘油的培养基中培养时，细胞能够产生碱性磷酸酶，并具有矿化能力，具备成骨细胞的生物学特性［3］。
　　在近年的实验研究中，人们过多地关注成骨基质在MSC分化过程中的作用，却忽略了细胞外基质结合行为对其分化的影响。有报道证明，胶原Ⅱ在软骨形成过程中表达最高，而胶原Ⅰ在骨化阶段沉积最多［4］。在体外实验中，MSC培养于胶原Ⅰ基质上时会发生成骨分化，并且需要与胶原Ⅰ结合整合素α2β1的相互作用[5]。细胞外基质蛋白通过结合细胞表面特异的整合素受体而影响细胞的生物学行为，这些受体能启动细胞内信号通路，控制基因表达、细胞骨架形成和细胞形态。显然，作为细胞外基质主要成分的胶原在MSC成骨分化过程中起了一定的作用。
　　本实验采用全骨髓培养法，将rMSCs直接加入培养瓶中而未先进行分离。由于rMSCs 贴壁生长，而造血细胞悬浮生长，经3代换液培养后能基本去除未贴壁细胞［3］。基于细胞外基质在MSC成骨分化过程中起一定作用，用构成细胞外基质主要成分的VN研究rMSC与细胞外基质结合对rMSC成骨分化的影响，并采用碱性磷酸酶染色［6］、硝酸银染色证明成骨分化的程度。结果显示，rMSC可与VN正常结合，并在共同培养第8天出现成骨分化倾向，第12天成骨分化明显，细胞呈典型成骨细胞表型，碱性磷酸酶活性增高，硝酸银染色显示有大量钙结节形成，证明rMSC与细胞外基质结合可能参与了成骨分化过程。rMSC是如何将与细胞外基质结合转化为MSC细胞分化行为，尚需进一步研究。

参考文献

　　[1]KNIPPENBERG M， HELDER M N， DOULABI B Z， et al. Adipose tissuederived mesenchymal stem cells acquire bone celllike responsiveness to fluid shear stress on osteogenic stimulation［J］. Tissue Engin， 2005，11(1112):17801788.

　　[2]JIANG Y， JAHAGIRDAR B N， REINHARDT R L， et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow［J］. Nature， 2002，418:4149.

　　[3]刘斌钰，李宁毅，樊功为，等. 大鼠骨髓间充质干细胞的培养鉴定及向成骨细胞诱导分化研究［J］. 齐鲁医学杂志， 2007，22(3):215217.

　　[4]BORTELL R， BRAONE L M， TASSINARI M S， et al. Gene expression during endochondral bone development: evidence for coordinate expression of transforming growth factor beta 1 and collagen type Ⅰ［J］. J Cell Biochem， 1990，44(2):8191.

　　[5]CATELAS I， SESE N， WU B M， et al. Human mesenchymal stem cell proliferation and osteogenic differentiation in fibrin gels in vitro［J］. Tissue Eng， 2006，12(8):23852396.

　　[6]叶发刚，夏长所，张卫兵，等. 兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定［J］. 青岛大学医学院学报， 2006，42(4):330332.

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