关于稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆的建立

【摘要】 目的 构建针对HPV16 E6基因的逆转录病毒载体，感染HPV16阳性宫颈癌细胞，筛选稳定表达HPV16 E6 siRNA的细胞克隆。方法 采用DNA重组技术构建表达靶向HPV16 E6基因的pSUPER.retro RNAi逆转录病毒载体，脂质体法将逆转录病毒载体转染入包装细胞PA317，G418筛选稳定产生逆转录病毒的细胞克隆，收集病毒上清，感染靶细胞SiHa，G418筛选出稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆，RTPCR检测细胞中E6 mRNA表达，细胞增殖实验检测细胞增殖力。结果 获及稳定产生逆转录病毒的细胞克隆，病毒感染靶细胞SiHa后，筛选出稳定表达HPV16 E6 siRNA的细胞克隆，RTPCR示HPV16 E6 mRNA表达受到抑制。细胞增殖实验示克隆细胞增殖率明显下降。结论 成功建立稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆，特异性的siRNA能抑制细胞生长、HPV16 E6 mRNA表达，HPV16 E6 siRNA可能成为治疗宫颈癌的一种新方法。
【关键词】 RNA干扰 DNA探针 HPV 宫颈肿瘤 克隆细胞
［ABSTRACT］ObjectiveTo construct a recombinant defective vector targeting HPV16 E6 gene，transfect into the HPV positive cervical carcimona cells and select clone cells with stable expression of HPV16 E6 siRNA. MethodsThe pSUPER.retro RNAi retrovirus vector expressing HPV16 E6 siRNA was constructed by recombinant DNA technology. The packaging cell PA317 was transfected with this recombinant plasmid using liposomebased transfection method and the stable integrant was selected using G418， the virus supernatant was collected and then infected SiHa cells， the cell clone that silenced of HPV16 E6 gene was obtained. The cell proliferative activity， HPV16 E6 messenger RNA (mRNA) expression were measured before and after the transfection by proliferation assay and reverse transcriptasepolymerase chain reaction， respectively. ResultsThe SiHa cells that stably expressed E6 siRNA were obtained. Compared with noninfected groups， the expression of E6 mRNA level was reduced remarkably. The proliferation was suppressed significantly in clone cells. ConclusionThe cell clone with stable expression of HPV16 E6 siRNA was constructed. The specific siRNA demonstrates inhibitory effect on cell growth and mRNA expression. This study indicates that siRNA HPV16 E6 can be used as a novel therapeutic approach for cervical cancer.
　　［KEY WORDS］RNA interference; DNA probes， HPV; uterine cervical neoplasms; clone cell
　　高危型人乳头瘤病毒（HPV）16和18型与宫颈癌的关系最为密切，HPV早期基因E6、E7编码产物E6、E7蛋白在宫颈上皮细胞恶性转化过程中起着非常重要的作用[1]。因此，宫颈癌的基因治疗可以通过阻断宫颈癌细胞中HPV E6和E7基因的表达来逆转其恶性表型。RNA干扰（RNAi）技术是近几年迅速发展起来的一项基因沉默技术，双链RNA诱导产生的siRNA是RNA干扰的效应分子[2，3]。2002年，BRUMMELKAMP等[4]学者构建了指导siRNA体内转录合成的pSUPER质粒载体，其诱导的基因沉默效应稳定而持久，具有可用抗生素筛选等优点。本实验采用pSUPER载体，成功构建了抑制HPV16 E6基因表达的逆转录病毒载体，获得了载体稳定整合入基因组、稳定表达E6 siRNA的细胞克隆，为进一步探讨E6基因沉默后HPV阳性宫颈癌细胞的生物学性状，以及RNAi技术在治疗宫颈癌中的应用提供了实验依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 细胞系和质粒 本文SiHa细胞系购自中国典型培养物保藏中心；包装细胞PA317、大肠杆菌E.cdi JM109细菌由青岛大学医学院微生物学教研室提供；pSUPER.retro.neo+gfp质粒购自美国OligoEngine公司；靶向E6基因的寡核苷酸由美国OligoEngine公司合成；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
　　1.1.2 主要试剂 限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶均购自大连宝生物有限公司；转染试剂Lipofectamine 2000购自美国Invitrogene公司； Polybrene、DEPC购自SIGMA公司； G418、逆转录试剂盒、PCR Marker、PCR反应体系、电泳缓冲体系购自美国Promega公司；TRIZOL购自美国GIBCO公司。
　　1.2 方法
　　1.2.1 靶向E6基因寡核苷酸的设计 应用美国OligoEngine公司提供的siRNA设计软件，将E6基因序列号AF404706输入后，该序列即自动选择19 nt的靶序列，其靶序列如下：5′AGCAACAGTTACTGCGACG3′。由OligoEngine公司合成60 nt两条互补单链，黑体字序列即为19 nt的靶序列，中间为9 nt的spacer区相隔，两端为保护碱基及HindⅢ和BglⅡ酶切黏性末端。
　　1.2.2 逆转录病毒载体的构建 选择OligoEngine公司的pSUPER.retro.neo+ gfp质粒作为载体。将合成的两条寡核苷酸片段溶于无菌无核酸酶的水中，终浓度为3 g/L，各取1 μL加入48 μL退火缓冲液中，按照下列条件进行退火反应：94 ℃ 4 min，80 ℃ 4 min，70 ℃ 10 min，37 ℃ 20 min，最终缓慢冷却到室温。分别用HindⅢ和BglⅡ双酶切的pSUPER. retro载体，先加入HindⅢ作用60 min，再加入BglⅡ继续反应2 h，然后65 ℃ 20 min终止反应。酶切产物于8 g/L的琼脂糖凝胶中电泳，长波紫外线灯下切取7 388 bp大片段，用QIAquick PCR 纯化试剂盒回收，得到带有BglⅡ和HindⅢ黏性末端的线性化载体。在T4 DNA连接酶的作用下与60 nt的双链寡核苷酸进行连接反应，构建靶向HPV16 E6基因的pSUPER E6载体。
　　1.2.3 重组质粒的转化和酶切鉴定 应用1×TSS两步法，参照文献[5]将重组质粒载体转化感受态细菌E.coli JM109，碱裂解法提取质粒。提取的重组质粒pSUPER E6行EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，同时用空质粒做阴性对照，37 ℃水浴过夜，取10 μL样品置于16 g/L的琼脂糖凝胶中90 V电泳25 min，在凝胶成像系统中观察结果。pSUPER E6重组质粒阳性克隆应该切出长281 bp大小的条带，而阴性对照的空质粒应该切出长约1 204 bp大小的条带。应用DNAStar设计软件设计引物，上游引物为5′CCCTTTATCCAGCCCTCACTCC3′，下游引物为5′GAAAAGCGCCTCCCCTACC3′， 以重组质粒为模板，可扩增出长384 bp的阳性产物。为进一步验证序列的准确性，将阳性产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
　　1.2.4 重组载体转染PA317包装细胞 PA317置6孔板中用含体积分数0.10胎牛血清的DMEM，37 ℃、体积分数0.05 CO2条件下培养，细胞汇合率达70%时用于转染。转染操作按Invitrogen 公司的 TransMessengerTM 转染手册进行。用无血清无抗生素的培养液洗涤单层细胞2次，加入无血清无抗生素的DMEM 2 mL，置37 ℃、体积分数0.05 CO2孵育箱中孵育10 min。将DNA脂质体逐滴加入，温箱孵育8 h后，加入含体积分数0.10胎牛血清的DMEM培养液至8 mL培养，次日换入新的含体积分数0.10胎牛血清的培养液。转染后48 h观察结，然后以1∶5进行传代，次日加入800 mg/L G418，2～3 d换液一次，9 d收集阳性克隆入培养瓶继续培养，G418改为200 mg/L，细胞长满瓶后传代或冻存，获得产逆转录病毒的PA317细胞克隆。
　　1.2.5 HPV16 E6基因沉默细胞克隆的建立 收集阳性PA317细胞克隆培养，上清用于感染靶细胞，注意尽量减少培养液的用量以提高病毒滴度。靶细胞SiHa在感染前1∶2传代，细胞生长达60%左右汇合时加病毒液3 mL 、Polybrene 12 μg混匀；置体积分数0.05 CO2、37 ℃培养箱培养24 h后换入新的含体积分数0.10胎牛血清的DMEM培养液；继续培养24 h后荧光显微镜下观察结果，评估病毒感染效率。G418筛选（同PA317细胞阳性克隆筛选），细胞90%汇合后传代，在不同时间冻存。
　　1.2.6 半定量RTPCR检测细胞中HPV16 E6 mRNA的表达 收集克隆细胞与未感染组细胞，TRIzol一步法提取细胞总RNA进行RTPCR检测。HPV16 E6及内参照βactin引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，E6引物参见文献[6]进行合成。内参照βactin引物:sense primer:5′CATCTCTTGCTCGAAGTCCA3′，antisense primer:5′ATCATGTTTGAGACCTTCAACA3′。 PCR反应条件:94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃ 5 min。
　　1.2.7 细胞增殖实验 取对数生长期的4组细胞，以每孔1×104接种于96孔板中，每组设6个复孔，置37 ℃、体积分数0.05 CO2培养箱培养，于1～5 d分别取出，胰酶消化，收集细胞吹打成单个细胞，用自动细胞计数仪计算细胞数，实验重复3次。
　　1.2.8 统计学方法 用SPSS 11.5软件进行处理，数值以±s表示，采用方差分析进行比较。
　　2 结　　果
　　2.1 pSUPER.retro.neo+gft质粒酶切后的电泳
　　质粒全长8 371 bp， BglⅡ和HindⅢ将质粒双酶切后，可观察到长约983 bp和7 388 bp的DNA片段。见图1。
　　2.2 重组逆转录病毒载体的鉴定
　　提取重组逆转录病毒载体进行测序，扩增产物长度384 bp，测序结果证实模板链已成功插入载体的正确位置。

2.3 产毒细胞克隆的建立
　　将逆转录病毒载体导入PA317细胞，转染12 h后可见GFP表达呈阳性，siRNA的表达与GFP的表达相一致。G418筛选阳性产毒细胞克隆，未转染成功的PA317细胞皱缩、脱落。
　　2.4 HPV16 E6沉默细胞克隆的建立
　　逆转录病毒感染靶细胞SiHa，荧光显微镜下计数，感染率可达93%，G418筛选阳性细胞克隆，小部分细胞出现死亡脱落现象，剩余细胞形成细胞克隆，荧光显微镜下观察，传代数次后仍可见荧光。
　　2.5 未感染组及克隆形成后传代5、20、35次SiHa细胞E6 mRNA表达水平
　　RTPCR技术的检测结果显示，克隆形成后传代5、20、35次SiHa细胞E6 mRNA的相对表达水平为0.350±0.056、0.710±0.084、0.960±0.067，与未感染组1.070±0.098相比及各克隆组间比较，差异有显著意义（F=50.41，q=5.56～16.00，P＜0.01）。
　　2.6 细胞增殖实验
　　克隆细胞的生长数较对照组减少（F=25.57～99.05，q=3.21～52.26，P&<0.001）。见表1。表1 各组SiHa细胞生长情况
　　3 讨　　论
　　E6主要与HPV细胞转化功能及致癌性有关，具有对病毒基因和细胞基因转录的反式激活活性，还能激活端粒酶，使细胞不能正常凋亡。E6蛋白可影响细胞周期的调控，在细胞转化及肿瘤形成中起着关键作用，还可与P53结合形成复合物，加速P53降解，使P53抑制细胞生长增殖作用消失，诱导癌变。RNAi是近年来发展起来的一种有效的基因沉默手段，siRNA与体内特定内源mRNA结合并使之降解，被认为是转录后水平抑制蛋白产生的机制[4，7]，尝试用RNAi抑制E6的表达已成为治疗宫颈癌的一个新的热点。
　　目前国内外学者在该领域的研究多采用瞬时转染的方法，缺点是作用时间短，2～3 d干扰达高峰，干扰基因大约1周后就恢复到原来水平。本实验选用pSUPER.retro.neo+gfp质粒具有三大优势：①能在启动siRNA的同时启动GFP基因，可直接在荧光显微镜下观察细胞中目的基因的转导及表达情况，具有方便、快捷、准确等优点；②能感染分裂期细胞，使目的基因稳定整合到靶细胞基因组，感染率高，克服瞬时转染因效率不同所带来的基因表达差异；③能长期表达，而不产生辅助病毒，具有很好的安全性。由于病毒滴度的高低，将直接影响目的基因转染靶细胞的效果，因此提高感染效率，即在靶细胞中产生高阳性表达是实验的基础。本实验采用PA317作为包装细胞，脂质体法稳定转染获得高的转染率，获及产毒细胞克隆，将产毒细胞扩增，能产生大量转录靶向HPV16 E6的逆转录病毒，将产毒细胞冻存为实验提供逆转录病毒的来源。收集逆转录病毒稳定感染靶细胞SiHa，G418抗生素压力筛选，获及稳定整合有pSUPER.retro.neo+gfp质粒的细胞克隆，显微镜下见荧光持续表达，稳定表达siRNA能维持长时间HPV16 E6基因沉默，满足实验的要求。
　　在研究中我们发现，E6基因沉默的克隆细胞E6 mRNA表达随时间延长表达逐渐增加，RNAi随 传代次数增多其抑制力减弱。这与TANG等[8]的结果一致，其指出针对HPV16 E6、E7的siRNA能在SiHa、CaSki细胞中稳定表达，抑制E6、E7癌基因的表达，siRNA的表达持续在同一水平，其抑制作用却只在早期传代的细胞中明显，随传代次数增多抑制作用减弱。TANG等指出，在siRNA抵抗的细胞胞浆中产生一种相对分子质量约为50 000的胞浆蛋白，能与之结合，抑制RNAi作用，其具体机制不清，有待于进一步研究。
　　本实验采用的逆转录病毒能感染分裂期细胞，使目的基因稳定整合到靶细胞基因组，并能长期表达，而不产生辅助病毒，具有很好的安全性。实验中提高转染、感染率，正确的筛选克隆细胞非常重要。另外，还应注意以下几点:①严格选择作用靶点，否则一个碱基的错配将大大降低siRNA对靶基因的抑制作用[9]；②高效性问题，找出一种高效且安全的siRNA递送方法，使siRNA只能对靶基因进行基因沉默，不对正常的基因或组织造成损害；③安全性问题，逆转录病毒载体存在潜在的致瘤危险性，实验中应做好个人防护，做好物品及废液的处理。
　　体内外实验和临床前实验证明，RNAi能作为各种病理情况下的治疗工具，最近报道首例RNAi用于治疗黄斑变性的病人，其结果令人鼓舞。然而，RNAi无疑是一把双刃剑，将RNAi技术应用于临床基因治疗，有许多问题需要解决。我们相信，随着基因技术的不断深入，RNAi技术应用于人类抗病毒、肿瘤等疾病的治疗一定会成为现实。
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