关于抑癌基因P53和癌基因MDM2在肾透明细胞癌中的表达及意义

【摘要】 目的 探讨抑癌基因P53蛋白、癌基因MDM2蛋白在肾透明细胞癌中的表达及发生、发展中的意义。方法 采用免疫组织化学法检测60例肾透明细胞癌、20例正常肾组织中抑癌基因P53、癌基因MDM2蛋白的表达情况。结果 60例肾透明细胞癌组织中P53阳性表达率为41.66%(25／60)，显著高于正常肾组织的10%(2／20)，差异有统计学意义(P＜0．05)；60例肾透明细胞癌组织中MDM2阳性表达率为53.33%(32／60)，显著高于正常肾组织的0%（0/20），差异有统计学意义(P＜0.05);P53和MDM2二者有一致性（χ２=2.9，P＝0.09）。结论 P53与MDM2共同参与肾透明细胞癌的发生、发展，P53与MDM2可作为评价肾透明细胞癌的生物学指标。
【关键词】 P53；MDM2；肾肿瘤；免疫组织化学
　　【Abstract】 Objective To investigate the expression of antioncogene P53 and cancer gene MDM2 proteins and their significance in the pathogenesis and progress of renal clear cell carcinoma.Methods To detect the expression of P53 and MDM2 in 60 cases of renal clear cell carcinoma and 10 cases of normal kidney tissues with immunohistochemical method.Results The positive rate of P53 in the tissues of the 60 cases of renal clear cell carcinoma is 41.66% (25/60)， much higher than 10% (2/20) when it is in the 20 cases of normal kidney tissues. There is statistical significance in the disparity (P＜0.05). Furthermore， the positive rate of MDM2 in the tissues of the 60 cases of renal clear cell carcinoma is 53.33% (32/60)， higher than 0% (0/20) when it is in the normal kidney tissues. Similarly， there is statistical significance of the disparity (P＜0.05).Therefore， P53 and MDM2 are positively correlated to a great extent(χ２=2.9，P＝0.09).Conclusion Both P53 and MDM2 participate in the pathogenesis and progress of renal clear cell carcinoma and they can be considered as the biological index to evaluate renal clear cell carcinoma.
　　【Key words】 P53，MDM2，kidney neoplasms，immunohistochemistry
　　肾透明细胞癌是人类泌尿系统常见的恶性肿瘤之一，且发病率呈增高趋势。P53是研究最多的抑癌基因，野生型P53基因(wtP53)具有维持基因组稳定、抑制或阻止细胞转化，从而抑制肿瘤发生的功能［1］。MDM2是一种进化保守基因，通过调节P53的功能而对细胞周期的控制是其重要作用。P53和MDM2在调节肿瘤细胞的生长、分化、凋亡、浸润、转移和肿瘤血管生成等各方面均具有重要作用［2］。本实验采用免疫组织化学方法检测了P53、MDM2在肾透明细胞癌患者标本及正常肾组织中的表达，探讨P53、MDM2在肾透明细胞癌发生、发展中的意义及其对肾透明细胞癌患者预后的影响。
　　1 材料和方法
　　1.1 材料 收集青海大学附属医院病理科存档的2007年4月—2008年10月经手术切除并经病理学证实的原发性肾透明细胞癌组织标本60例，其中，男38例，女22例，年龄36～78岁，中位年龄59.4岁。术前均未接受化、放疗。肿瘤高中分化35例，低分化25例；未侵犯外膜者23例，侵犯外膜者37例；无淋巴结转移者34例，有淋巴结转移者26例.Robson分期: Ⅰ期4例，Ⅱ期39例，Ⅲ期17例，Ⅳ期0例。对照组20例肾组织均取自离肿瘤2 cm以上的正常肾组织，术后标本经10％福尔马林固定、石蜡包埋。P53、MDM2鼠抗人单克隆抗体，免疫组化EliVision试剂盒、DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司。
　　1.2 方法 常规石蜡包埋切片，制成5 μm厚连续切片，黏附于APES处理过的载玻片上，75℃烤片1 h，脱蜡，水化，蒸馏水浸泡冲洗，免疫组织化学染色：①高温高压抗原修复；②用PBS液冲洗（5 min×3次），3%h3O2室温下孵育10 min（以清除过氧化物酶的活性），用PBS液冲洗（2 min×3次）；③5%～10%正常山羊血清封闭，室温下孵育10 min；④除去血清，分别滴加P53、MDM2一抗工作液，4℃冰箱过夜，PBS液冲洗（5 min×3次）；⑤滴加生物素标记的二抗，37℃孵育30 min，PBS液冲洗（5 min×3次）；⑥滴加SABC复合物，37℃ 30 min，PBS冲洗，（5 min×3次）；⑦滴加DAB底物，孵育10 min左右显色；⑧流水冲洗，苏木素复染，盐酸酒精分化，氨水返蓝。逐级酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。用已知阳性标本作阳性对照；以PBS液代替一抗作阴性对照。
　　1.3 结果判定 肿瘤细胞核染成棕黄色或棕褐色，胞浆染成浅黄色或棕黄色为阳性反应，染色结果参照文献［3］评分方法，以每张切片在400倍镜下均观察整体染色情况，选择5个有代表性的区域，每个区域计算200个细胞。阳性细胞数计分：阳性数＜5%为0；阳性数＞5%，但≤35%为1；阳性数＞35%，但≤70%为2；阳性数＞70%为3。着色强度计分：不着色为0，弱着色（呈淡棕黄色）为1，强着色（呈明显的棕黄色)为2。阳性分级：以上两项相加，0～1分为（－），2分为（±），3分为（+），4分为（++），5分为（+++）：+～+++计为阳性，－～±计为阴性。
　　1.4 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件包进行统计学分析，各指标之间相关因素的差异性比较采用χ2检验或连续性校正χ２检验，各指标间的相关性研究采用配对四格χ2检验和一致性检验，P＜0.05为有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 肾透明细胞癌组织中P53、MDM2的表达 见表1。P53、MDM2染色结果:正常细胞偶见P53染色、未见MDM2染色，MDM2、P53在肾透明细胞癌组织呈阳性表达见图1、图2，其表达率显著高于正常肾组织(P＜0.05。)表1 P53、MDM2蛋白在正常肾组织、肾透明细胞癌组织中的表达组织学分类nP53蛋白阳性数阳性率
　　2．2 P53、MDM2蛋白表达与肾透明细胞癌临床病理因素的关系 见表2。表2 P53及MDM2蛋白表达与肾透明细胞癌临床病理特征的关系
　　2．3 肾透明细胞癌组织中P53与MDM2间的关系 两者之间经配对χ2检验，χ2=2.9，P=0.09，一致性Kappa=0.44，即两种基因表达差异无统计学意义，但有一致性，见表3。表3 P53 MDM2蛋白在肾透明细胞癌中表达的相关性
　　3 讨论
　　肿瘤的形成是细胞内多个基因的事件，包括原癌基因和抑癌基因两大类。人类P53基因定位于17号染色体(17p13，17 )，有11个外显子和10个内含子，编码393个氨基酸残基的P53蛋白，P53蛋白分为野生型及突变型两种，野生型蛋白在所有正常细胞中呈低水平表达，但突变型蛋白在肿瘤细胞中常常高表达。大量的研究表明野生型P53 (wt2P53)主要参与DNA的修复和复制过程，DNA损伤后，P53基因活化，从而使P53依赖的细胞周期素依赖激酶(CDK)抑制剂p21waf1和DNA修复基因GADD45的转录上调，使细胞在G1期出现生长停滞，进行DNA修复。在P53基因缺失或突变的细胞，DNA损伤后不能通过P53介导的途径进入G1期停滞和DNA修复，遗传信息受损的细胞进入增殖，最终导致恶性肿瘤的发生［1，4～6］，但由于其半衰期短，不易被检测出，然而突变型P53基因半衰期长，因此可以认为， 免疫组化法阳性即提示为突变型P53基因的存在［7］。P53正常功能的丧失，最主要的方式是基因突变，迄今已发现10 000种人类肿瘤的2 500种基因突变，P53蛋白393个氨基酸有280个以上发现了突变［8］。另外，一些蛋白质与P53蛋白作用，也可导致其正常生物学功能的丧失。Storey等［9］已经证实人子宫颈癌、直肠癌的发生发展与HPVE6引起的P53蛋白功能的丧失有密切关系。

转贴于 　　MDM2基因最初是自发肿瘤鼠Balb/c3T3成纤维细胞系中鉴定出来的，人的MDM2基因位于12号染色体长臂12q［10］，其转录产物mRNA广泛表达于正常人体的多个器官，骨骼肌含量最高，其次为肝、肺、胰等，与细胞基本生理活动有关［11］。MDM2最重要的作用是抑制wtP53 基因的激活转录功能和抗肿瘤活性。其主要通过与P53形成复合物或加速P53的分解，而高水平的MDM2基因产物本身也可以使P53的功能失活，抑制P53的功能，对P53起负调节的作用［12］。已有研究结果表明，MDM2 与一些肿瘤的发生发展密切相关［13］。MDM2基因编码的P90蛋白能够与P53基因结合，使P53基因失去正常功能，导致肿瘤的发生。MDM2基因突变或表达异常将导致平衡的破坏，可能与细胞转化和肿瘤的发生有关。MDM2除抑制抑癌基因P53产生，其本身也有致癌作用。MDM2在细胞转化过程中起癌基因作用的证据很多［14］。本文结果显示，肾透明细胞癌组织中MDM2的表达要明显高于正常对照组，MDM2的表达随Robson临床分期增高而增加，有淋巴结转移者MDM2表达要高于无淋巴结转移者，MDM2过度表达与肾透明细胞癌的高病理级别和高临床分期相关，提示MDM2可促进肿瘤细胞向恶性化方向分化，并促进肿瘤的进展。有淋巴结转移患者肾透明细胞癌组织中，P53染色阳性率明显增高，说明肾癌细胞P53的过度沉积可诱导或促进肿瘤的浸润和转移。在本组中，MDM2与P53二者有一致性( χ２=２.９，P＝０.０９)，提示二者在肾透明细胞癌发生、发展中起协同作用，共同参与肾透明细胞癌进程。当然，二者亦可能有各自独立的作用过程，通过不同机制促进肾透明细胞癌的发展，目前仍需进一步研究。

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