[摘要] 目的:探讨自组装短肽纳米纤维凝胶支架可能的创伤修复机制并验证`其修复效果。方法:以短肽纳米纤维为修复原料，利用深Ⅱ度和Ⅲ度皮肤烧伤动物模型，验证生物材料对烧伤创面的影响。结果:RADA16 -Ⅰ处理组烧伤创面及其周围正常组织的毛发生长旺盛(P<0.05)，在烧伤后急性修复期(24 h)创面根部毛囊和腺体中角蛋白19强表达。结论:自组装短肽纳米纤维凝胶支架对深度烧伤皮肤创面毛发等附属器官有保护及促进作用。
[关键词] 烧伤;美学修复;纳米纤维
[Abstract] Objective: To explore the effect of peptide RADA16-I on aesthetic repair of burn wounds. Methods: Observed regeneration of hair and glands after repair by means of RADA16-Ⅰdressing utilizing deep Ⅱ degree and Ⅲ degree skin burn wounds as models. Results: The hairs of burn wounds and around normal organization were vigorous growth in RADA16-Ⅰ group(P<0.05)， keratin 19 of wounds roothair follicle and glands was strong expression in acuterepairstage(24 h)after burn. Conclusion: Hair growth on the deep burn wound after repair is more vigorous by means of RADA16-Ⅰcompared with those utilizing other biological materials.
[Key words] Burn;Aesthetic repair;Nano-fibrer
皮肤烧伤创面是一种特殊的皮肤创伤，人们越来越重视皮肤烧伤后创面的修复的外观。健全和良好的皮肤修复取决于皮肤结构完整再生。在深度烧伤创面修复，再生的皮肤结构差，可能导致瘢痕挛缩和畸形。腺体、毛发等皮肤附属器官的再生作为评价皮肤烧伤创面美学修复的指标。头发的深度烧伤创面修复时由于感染，延迟愈合等原因，肉芽组织过度填充代替正常上皮增生，而造成瘢痕。笔者通过观察短肽处理的深度烧伤皮肤表面的毛囊增生及烧伤创面早期分化表皮干细胞的表面标志角蛋白19的表达进行研究[1-2]。
1材料与方法
1.1实验敷料
自组装肽:RADA16 -Ⅰ(PuraMatriTM，1%质量/体积，分子理论质量= 1 712.9道尔顿)购买自3DM公司(剑桥，麻省)。以纯水稀释成溶液(质量/体积)。1%和0.5%RAD16 -Ⅰ肽在稀释后4℃储存备用。
1.2动物
16只雌性SD大鼠购自四川大学华西医学中心实验室，重量250～290 g。实验前半小时腹腔注射10%水合氯醛(25 ml/kg体重)给予麻醉。注射后，动物转移到温暖的环境中以保持动物的体温。刮去SD大鼠背部的毛发，75%的医用酒精消毒。应用温控电子金属探头[3]，脊柱两侧使两个对称部位制造直径<3.0 cm的烫伤创面。伤口边缘清晰。深Ⅱ度烧伤温控在90℃，持续时间为8 s，Ⅲ度烧伤创面18 s 94℃。每个深Ⅱ度烧伤创面给予50 μl短肽，Ⅲ度烧伤创面100 μl。每个伤口上覆盖一层薄薄的凡士林纱布。伤口开始在1个星期后结痂。
1.3实验分组
12只SD大鼠用于Ⅲ度烧伤创面模型，分为RADA16-Ⅰ组，壳聚糖组，胶原蛋白组，每组4只，分别以RADA16-Ⅰ，壳聚糖和胶原蛋白处理，并与空白对照组(4只)对比。观察指标是烧伤皮肤表皮干细胞表面标志角蛋白19的表达。实验方法是免疫荧光组织化学病理染色，观测时间是伤后24 h、4 d、7 d。4组大鼠8个创面随机分别用1%RADA16-Ⅰ治疗，壳聚糖组和胶原蛋白组与空白对照组对比。采用HE染色。观察时间:烧伤后30、60和70 d。
1.4伤口愈合的形态学研究
成形后的伤口，伤口的照片和采取的大体形态观察伤口，包括每天的头发烧伤创面及其周围的增长。
1.5组织学检查
在烧伤后30、60、70和80 d，切取烧伤创面皮肤，并将其周围正常皮肤组织进行病理组织学检查。然后，所有样本分别固定在4%中性甲醛，酒精系列脱水，石蜡包埋。切取5 μm厚的连续切片进行HE染色。
1.6免疫荧光组织化学染色
5 μm厚的大鼠皮肤冰冻切片，空气中干燥30 min。以免疫荧光分析法检测反应伤口，伤口周围的皮肤与正常皮肤表皮干细胞表面标志角蛋白19的表达。5%牛血清清蛋白中4℃孵育3 h去除非特异性结合蛋白(过氧化物酶标记链霉亲和素，购买自北京中山金桥生物技术有限责任公司)。孵育的切片滴加抗体。初级抗体(小鼠单克隆抗角蛋白#19，1∶100稀释，从美国Inc.TM购得)。标本在4℃ 12 h下，在二级抗体rhodammine(TRITC)罗丹明荧光探针标记的纯羊抗鼠IgG(ZSGB生物北京)抗体，1 h避光4℃保存。然后切片滴加DAPI[6二眯基 - 2 -苯基吲哚盐酸盐水合物，购自Sigma(D-9542)，1∶500]。阴性对照组，一抗用PBS代替。Olympus- X71-倒置莱卡DMRB免疫荧光显微镜观测，并显微摄影。短肽及空白实验组的皮肤样本，并在每组3个部分皮肤样本中选择视野，放大倍数是200 ×，随机选择6个视野。荧光共聚焦显微镜观测样本中收集到的序列图像，使用图像分析软件Image Pro Plus 5.0合成总体光密度值。
1.7 统计学分析
所有的定量数据显示为均值±标准差(x±s)。使用独立样本t检验，可信区间为95%。组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，其次是Turkey，正态分布式数据采用posthoc测试。
2结果
2.1毛囊生长
研究人员以病理染色方法观察烧伤创面的毛发生长。该观测时间分别为烧伤后30、60、70和80 d。与壳聚糖组，胶原蛋白组和空白对照组比较，RADA16-Ⅰ处理组烧伤创面及其周围正常组织的毛发生长旺盛(P<0.05，图1)。
2.2角蛋白19的表达
RADA16-Ⅰ治疗组荧光染色结果显示，在烧伤后急性修复期(24 h)创面根部毛囊和腺体中角蛋白19强表达，在胶原组呈弱表达，空白对照组和壳聚糖组几乎没有表达(P<0.05)。
用图像处理软件获得积分光密度为代表的角蛋白19荧光染色结果表明:角蛋白19的表达在烧伤后24 h、4 d、7 d后，其表达在各组均依时间延长而逐步减少，各组在第14天没有明显的表达，这表明，创面根部毛囊和腺体中角蛋白19的强表达主要集中于修复的早期阶段。
3讨论
生物材料移植或应用于动物体内后，宿主在其表面一系列生物材料引发的宿主反应，包括蛋白质的吸收，活化补体，细胞聚集或黏附(医学生物膜)，从广义上还包括炎症反应及纤维化。第三代生物材料应用目的，是希望通过放置材料与生物膜表面所提供的良好细胞诱导生长环境利于靶细胞对蛋白质的吸收，免疫应答，细胞因子和生长因子的释放。
根据研究人员的观察，肽RADA16 -Ⅰ治疗组烧伤创面及伤口周围头发生长比对照组旺盛。在此基础上，笔者以免疫荧光染色的方法在进一步验证了急性期创面根部毛囊和腺体表皮干细胞中角蛋白19的表达，得到的结果与毛囊生长是一致的。进一步观察表明，在RADA16-Ⅰ治疗组创面修复后期胶原排列有序。可能的修复机制:RADA16提供了一个适合创面修复细胞外部环境;保存湿润的创面环境，有利于对各种腺体及细胞(包括表皮细胞，成纤维细胞，腺细胞和毛囊干细胞)的再生和修复;有利于胶原蛋白重排及健全和美观的皮肤修复[4-6]。
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参考文献
][1]Zhao XJ， ZhangSG.Self-assembling nanopeptides become a new type of biomaterial[M].Polymers for Regenerative Medicine， Heidelberg:Springer Berlin， 2006:145-170.
[2]Caplan MR，Schwartzfarb EM， Zhang S， et al. Effects of systematic variation of amino acid sequence on the mechanical properties of a self-assembling， oligopeptide biomaterial[J].Journal of Biomaterials Science-Polymer Edition，2002，13(3): 225-236.
[3]Fan KW， Zhu ZX， Den ZY. An experimental model of an electrical injury to the peripheral nerve[J].Burns， 2005，31(6): 731-736.
[4]Milisavljevic V，Freedberg IM， Blumenberg M. Close linkage of the two keratin gene clusters in the human genome[J]. Genomics，1996，34(1):134-138.
[5]Papp A，Kiraly K， Harma M，et al.The progression of burn depth in experimental burns: a histological and methodological study[J]. Burns，2004，30(7): 684-690.
[6]Ramakrishnan KM，Jayaraman V.Management of partial-thickness burn wounds by amniotic membrane: A cost-effective treatment in developing countries[J]. Burns，1997，23(Suppl 1):S33-S36.