关于阿司匹林对MCF7细胞uPA表达的影响

　　　　　　　　　　 作者：陈绍水 宁方玲 赵磊 纪春祥

【摘要】 目的 观察阿司匹林对乳腺癌细胞MCF7增殖的影响，探讨阿司匹林新的抗肿瘤作用机制。方法 MTT法检测不同浓度的阿司匹林(2.5、5.0和10.0 mmol/L)作用于人乳腺癌细胞株MCF7不同时间(24、48和72 h)的细胞增殖抑制率；应用Western blot检测阿司匹林对MCF7乳腺癌细胞尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂(urokinase type plasminogen activator， uPA)表达。结果 阿司匹林各剂量组细胞增殖抑制率随药物浓度的增加、作用时间的延长而提高(P＜0.01)；MCF7细胞uPA的蛋白表达量随药物浓度的增加、作用时间的延长而降低。结论 阿司匹林有抑制人乳腺癌细胞MCF7增殖的作用， 并且呈时间依赖性和剂量依赖性；阿司匹林可以抑制MCF7细胞的uPA表达，这可能是阿司匹林抗乳腺癌的分子机制之一。
【关键词】 阿司匹林；尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂；乳腺癌细胞MCF7
　　【Abstract】 Objective To explore the molecular mechanism of antitumor effects of aspirin on breast cancer cell MCF7.Methods The human breast cancer cell MCF7 was treated with 2.5， 5.0， and 10.0 mmol ·L-1 aspirin for 24， 48， and 72 h respectively， the inhibitory effect was detected by MTT assay. Western blot was used to observe the expression of uPA in MCF7 cells treated by aspirin.Results The inhibitory rate of the MCF7 cell line treated with aspirin was reduced compared with controls， which was in time and dosedependent manner (P＜0.01). The expression of uPA　 decreased after treated with aspirin， which also had a time and dose dependence. Conclusion Aspirin has inhibitory effects on the growth of human breast cancer cell MCF7 in a dose and time dependent manner， and inhibits the expression of uPA in breast cancer cells， which is possible one of the molecular mechanisms of aspirin in breast cancer.
　　【Key words】 aspirin，urokinase type plasminogen activator，human breast cancer cell MCF7
　　非甾体类消炎药(Nonsteroid antiinflammatory drugs，NSAIDs)在肿瘤防治中的作用越来越受到重视。在对结肠癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的基础和临床研究中发现，NSAIDs对上述肿瘤均有明显的抑制作用 ［１，２］。然而，以往的研究方向主要集中在NSAIDs通过对环氧化酶2(cyclooxygenase2，COX2)的抑制，进而达到对恶性肿瘤的控制［3，4］。尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase type plasminogen activator，uPA)在肿瘤血管生成过程中发挥着重要的作用，在乳腺癌中有较高的表达。本研究通过观察阿司匹林作用于MCF7细胞后uPA表达的变化，进一步探讨阿司匹林对人乳腺癌细胞的生物学效应和可能的作用机制。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料 ①主要试剂: 阿司匹林购于阿斯利康制药有限公司；阿霉素购于浙江海正药业；鼠抗人单克隆uPA抗体(Data Sheet公司)。②细胞株：MCF7细胞株(中科院上海细胞所)。常规培养于含有10 %小牛血清、100 u青霉素，100 u链霉素的LDMEM培养液中，37℃、5%CO2 培养箱中贴壁培养， 当细胞生长至80 %融合时，0.25 %胰蛋白酶消化传代。
　　1.2 MTT法检测阿司匹林对乳腺癌细胞增殖的抑制率 取对数生长期的MCF7细胞，按传代方法制成单细胞悬液，计数，接种于96孔培养板，每孔加细胞悬液100 μl (相当于1×104个细胞)，取不含细胞的培养液作为空白调零。将培养板置于37℃、5%CO2培养箱中贴壁培养24 h后，各孔分别加入含终浓度为2.5、5.0和10 mmol/L阿司匹林及含终浓度为0.5、1.0和2.0 μmol/L阿霉素（阳性对照组）的培养液，以不含药物的培养液作为阴性对照组，每组设3个复孔。分别培养24、48和72 h后每孔加0.5% MTT 20 μl，继续培养4 h后，小心吸除孔内液体，每孔加二甲基亚砜100 μl，震荡10 min后，用酶标仪在490 nm波长处测定各孔的吸光度值(A值)。按下式计算细胞增殖的抑制率: 抑制率(%) = (1－实验组平均A值/对照组平均A值) ×100 %。
　　1.3 Western blot分析检测uPA的蛋白表达 提取实验各组细胞总蛋白，用Brodford法测定含量后取40 μg总蛋白进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳并电转移至硝酸纤维素膜(NC)上，将含1%牛血清白蛋白(BSA)和5% tween20的磷酸盐缓冲液(PBST)封闭1 h，应用uPA单抗，生物素化二抗及辣根过氧化物酶(HRP)标记的链酶卵白素三抗孵育后3，3′二氨基联苯胺(DAB)显色。
　　2 结果
　　2.1 阿司匹林和阿霉素对乳腺癌细胞增殖的影响 阿司匹林和阿霉素各剂量组的抑制率随药物浓度的增加、作用时间的延长而提高，见表1。表１ 阿司匹林和阿霉素对人乳腺癌 细胞MCF7的抑制注：阿司匹林组：F= 7.380，P＜0.01;阿霉素组:F= 11.943，P＜0.01
　　2.2 阿司匹林对MCF7细胞uPA蛋白表达的影响 免疫印迹分析检测蛋白表达结果以NC膜上棕染条带的深浅来判断，条带显色越深，提示该种蛋白表达量较高。Western blot结果显示，MCF7细胞分别经2.5、5.0和10 mmol/L阿司匹林作用24、48、72 h后，uPA抗体染色条带随药物浓度的增加逐渐变浅；在同一浓度中随着处理时间的延长，染色条带逐渐变浅。表明MCF7细胞uPA表达量与阿司匹林浓度和作用时间相关，阿司匹林能降低MCF7细胞uPA的表达。
　　3 讨论
　　近年来，在NSAIDs临床应用与研究的同时，人们发现其有防治肿瘤的作用。1982年Doubilet首次报道了长期服用阿司匹林的人群较普通人群结直肠癌的发病率明显降低，此后数项大样本流行病学研究都得出了类似的结论。据美国俄亥俄州大学的科研人员通过对两千余名妇女的多年观察，其中每周至少服3次阿司匹林达5年的妇女，患乳腺癌的危险性可以降低1/ 3。美国路易司安那州的研究人员发现，给予小剂量阿司匹林治疗乳腺癌，结果癌体缩小，转移率下降，生存率提高。本研究将传统的NSAIDs阿司匹林作用于乳腺癌细胞MCF7，结果显示阿司匹林对MCF7细胞有抑制作用，且其作用具有剂量依赖性和时间依赖性，剂量越大，作用时间越长，抑制作用越明显(P＜0.01)， 10 mmol/L阿司匹林作用72　h，抑制率可达68.88%; 阳性对照阿霉素2.0 μmol/L作用72 h，抑制率为86.30%。由此可见，阿司匹林可达到与阿霉素几乎相同的抗乳腺癌的作用。

阿司匹林抗肿瘤的作用机制是当前研究的热点之一，主要包括：①抑制环氧化酶2(COX2)的活性：环氧化酶是前列腺素(PGs) 合成的关键酶，在体内有两种异构体，即COX1和COX2。研究发现COX2与消化道肿瘤的发生、发展密切相关。阿司匹林等抗炎药能抑制前列腺素合成酶的活性，使PGs合成减少，从而抑制肿瘤细胞的生长增殖。绝经后乳腺癌患者体内的雌激素主要由雄激素在芳香化酶作用下转化而来，在正常及恶性乳腺组织中激发芳香化酶表达的启动子序列是不同的。其中恶性组织特异性启动子是在cAMP的调控下，而由COX2作限速酶生成的PGE2是乳腺癌细胞中生成cAMP的刺激剂 ［４］，因此COX2选择性抑制剂可抑制肿瘤相关芳香化酶表达。②抑制新生血管形成：肿瘤的快速生长需要大量血液供应，具有抑制肿瘤血管生成的药物可特异性地抑制肿瘤的生长。血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是最重要的促进血管生成因子。Kirkpatrick等［５］发现，PGs可以促进VEGF及bFGF的表达，用COX2抑制剂阿司匹林可减少成纤维细胞和肿瘤细胞VEGF的产生，防止其诱导的内皮细胞促丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的活化，后者的活化可以促进血管内皮细胞的增殖和新生血管的形成。③诱导肿瘤细胞凋亡：许多研究证实，阿司匹林及其他非甾体类抗炎药可通过诱导肿瘤细胞凋亡而抑制肿瘤生长。目前的研究显示，非甾体类抗炎药可通过COX2依赖性和非依赖两条途径来诱导肿瘤细胞凋亡，但其确切分子机制仍不清楚［６］。此外，阿司匹林还可以通过干扰线粒体能量代谢、抑制磷酸戊糖途径、增加活性氧的活性而诱导凋亡［７］。
　　尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)是一种丝氨酸蛋白酶，在乳腺癌患者中有较高的表达，它能诱发整个细胞外基质和基底膜的降解破坏，从而促使肿瘤发生侵袭和转移，同时在肿瘤血管生成过程中也发挥着重要的作用［８］。本研究结果提示，阿司匹林可下调uPA的表达，且有明显的时间和剂量依赖性，这可能是阿司匹林抑制肿瘤细胞的新的机制之一。

参考文献

［１］　Soslow R， Dannenberg A， Rush D，et al. COX2 expression in human pulmonary， colonic and mammary tumor［Ｊ］.Cancer， 2000， 98(12): 26372645.

［２］　雷俊华， 王　杨， 程少会. 环氧化酶2在胃癌组织中的表达及与病理参数的关系［Ｊ］.吉林大学学报（医学版），2006 ，32(3): 476479.

［３］　战淑珺，江泽飞，宋三泰. COX2抑制剂与乳腺癌关系研究进展［Ｊ］.癌症进展， 2005，3(1): 4548.

［４］　Davies GL. Cyclooxygenase2 and chemoprevention of breast cancer［Ｊ］.J Steroid Biochem Mol Biol， 2003， 86(325):495499.

［5］ Kirkpatrick K， Ogunkolade W， Elkak A，et al. The mRNA expression of cyclooxygenase2 (COX2) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in human breast cancer［Ｊ］.Curr Med Res Opin， 2002， 18(4):237241.

［6］ Marx J. Cancer Research: Antiinflammatories inhibit cancer growthBut How［J］？Science， 2001， 291 (5504): 581582.

［7］ Kusuhara H， Komatus H， Sumichika H，et al. Reactive oxygen species are involved in the apoptosis induced by nonsteroidl antiinflammatory drugs in cultured gastric cells［Ｊ］.Eur J Pharmacol， 1999， 383(3):331337.

［８］　Duffy MJ. The urokinase plasminogen activator system: role in malignancy［Ｊ］.Curr Pharm Des， 2004， 10(1): 3949.