关于HPLC法测定不同产地甘草中甘草酸的含量

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【摘要】 目的 用HPLC法测定甘草中甘草酸的含量。方法 以C18柱（4.6 mm×15 cm，5 μm）为分析柱，乙腈2％醋酸溶液（36∶64）为流动相；流速为0.6 ml/min， 柱温25℃，紫外检测波长为250 nm，采用外表法定量测定。结果 表明甘草酸在0.1630～0.8149 μg范围内呈良好的线性关系(r=0.9999)。其平均加样回收率为99.76%，RSD为0.96%(n=5)。结论 本方法简便可靠，重现性好，可作为甘草酸的质量控制方法。
【关键词】 甘草 甘草酸 高效液相色谱法 含量测定
　　【Abstract】 Objective To set up a HPLC method for the determination of the glycyrrhizic acid in licorice from different regions. Methods A C18 column（4.6mm×15 cm，5μm）was used with the mobile phase consisting of acetonitrile2% acetic acid (36∶64).The flow rate was 0.6 ml/min， the temperature of column was 25℃， and the detection wavelength was at 250nm. To determinate the quantitative assay using external satadard method.Results The linear of glycyrrhizic acid was good in the range of 0.1630～0.8149 μg (r=0.9999) with the average recovery 99.76% and RSD 0.96%(n=5).Conclusion This method was simple， convenient， and was appropriate to control the quality of licorice.
　　【Key words】 licorice，glycyrrhizic acid，HPLC，determination
　　甘草为豆科多年生草本植物，始载于《神农本草经》，素有“国老”之称，是我国一味非常重要的中药材，具补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药之功效［1，2］。甘草中含有甘草酸和甘草苷等物质，其中甘草酸是最重要的活性成分［3，4］，具有抗炎、抗溃疡、抗肝毒素以及抗癌等药理作用。目前，还发现其具有体外抗甲肝病毒、人体免疫缺陷病毒和SARs病毒的活性，临床上用于治疗慢性肝炎和艾滋病［5，6］。《中药药典》收载的品种为甘草的干燥根及根茎［7］。但实际上，商品甘草的产地来源复杂，其有效成分甘草酸的含量也存在很大差异。为此，本文作者以甘草中有效成分甘草酸为检测指标，采用HPLC法，对甘肃和山东4个产地的甘草进行了初步的分析研究。
　　1 材料与方法
　　1.1 仪器 HP1100高效液相色谱仪，YCQ300超声波清洗器（上海凯波超声设备有限公司），AD ER182A型电子天平。
　　1.2 试药与方法 甘草酸单铵盐（由中国药品生物制品检定所提供，批号07049912）；甘草样品经本实验室鉴定为豆科植物的干燥根及根茎；甲醇、乙腈为色谱纯；95%乙醇、无水乙醇均为分析纯；冰醋酸为优级纯；水为双蒸水。
　　1.2.1 色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（C18柱，4.6mm×15cm，5 μm）；乙腈2％醋酸溶液（36∶64）为流动相；流速为0.6 ml/min；柱温25℃；紫外检测波长为250 nm。
　　1.2.2 对照品溶液的制备：取甘草酸单铵盐对照品10 mg，精密称定，置50 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；再精密吸取2 ml置10 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。每1 ml甘草酸单铵盐对照品0.0416 mg，折合甘草酸为0.0407 mg。
　　1.2.3 供试品溶液的制备：取本品内容物0.5 g，精密称定，加50 ml甲醇，超声处理45 min，放冷，滤过，置100 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀即得。
　　1.2.4 标准曲线及线形范围：分别精密吸取对照品溶液4.0、8.0、12.0、15.0、20.0 μl，注入液相色谱仪，在上述色谱条件下测定。以对照品进样量（μg）为横坐标，5次测得的峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，见表1。得回归方程为Y=1062108X＋30988(r=0.9999)。结果表明甘草进样量在0.1630～0.8149 μg范围内线性关系良好。 表1 甘草酸标准曲线数据进样量
　　1.2.5 精密度实验：精密吸取同一对照品溶液10 μl，重复进样5次，记录色谱图，以峰面积计算其RSD为0.72%，说明仪器操作过程中精密度良好。
　　1.2.6 稳定性：取甘草药材按供试品溶液制备项下的方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12 h进样，每次进样10 μl，测定甘草酸峰面积计算含量，得甘草酸的RSD为0.95%。
　　1.2.7 重现性：取甘草药材按供试品溶液制备项下的方法制备5份供试品液，分别进样，每次进样10 μl，测定甘草酸峰面积，计算含量， 得甘草酸的RSD为1.04%。
　　1.2.8 加样回收率：精密称取已知含量的甘草药材适量，分别精密加入一定量的甘草酸对照品，结果甘草酸的平均加样回收率为99.76%， RSD为0.96%(n=5)。
　　1.2.9 样品测定：按上述供试品溶液的制备方法和测定条件，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μl，测定4批不同产地的样品，结果见表2。表2 甘草中甘草酸的含量测定结果
　　3 讨论
　　3.1 提取溶剂与方法 本文作者在研究过程中，曾试验用乙醇溶解浸泡甘草药材，通过回收乙醇，残渣回流3 h得到甘草酸，但此方法操作繁琐，且甘草酸成分复杂，不易过滤。后来采用超声提取处理，超声提取对于一些中药有效成分的提取是一种十分有效的方法，且操作简单、快速，而且得到的甘草酸成分纯度比较好。根据甘草中主要化学成分有皂苷（如甘草酸）和黄酮（如甘草苷）等物质，作者考察了不同溶剂的提取，结果以甲醇超声提取最好，且样品干扰少；同时也考察了超声时间（30、45、60 min）对提取的影响，结果显示超声处理45 min，获得的色谱图出峰多，且分离度、分辨率都较为理想［8］。
　　3.2 检测波长 本实验采用250 nm作为检测波长，也是为了兼顾其他峰的吸收［9］。为了反映药材化学成分的全貌，选用不同的检测波长，本文作者突出其它的特征峰，相互参照辨认，避免了图谱中仅有一种成分偏高的现象。甘草中甘草酸含量较高，在色谱图中占有绝对优势，其他特征峰很弱。本实验为了图谱中能突出甘草酸的特征外，也同时突出其他的特征峰，故选用250 nm检测［10］。

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　　甘草酸为甘草的主要有效成分，其含量的多少，可判断甘草质量的优劣。甘草酸的含量常因生长区域不同而有较大的区别，以甘草酸为检测指标进行含量测定。结果表明，不同产地的甘草，其甘草酸的含量有较大差异，甘肃会宁甘草样品中甘草酸含量最高，其质量百分含量达到40.23%。这为各医院中药房和药店的采购人员提供进货依据，并为临床中医师提供处方用量参考。
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