关于强直性脊柱炎与HLA B2704, 05亚型分布关系

【摘要】 目的： 用流式芯片以及PCR技术检测HLAB2704， 05亚型，提供临床诊断强直性脊柱炎的新方法. 方法： 对124例强直性脊柱炎患者及50例正常人采用流式细胞方法检测HLAB27，采用流式芯片方法检测HLAB27亚型. 结果： 124例强直性脊柱炎患者HLAB27阳性数116例，阳性率94%，其中HLAB2704亚型68例，占总阳性数的58.6%，HLAB2705亚型48例，占总阳性数的41.4%. 50例正常人的亚型检测结果均为HLAB2704阳性. 结论： 强直性脊柱炎患者的发病机制与各亚型的特异序列无关，仅与HLAB27各亚型共有序例有关，流式芯片技术可以快速准确地对HLAB27相关亚型作出分析，为深入探讨强直性脊柱炎发病机制奠定工作基础，并提供强直性脊柱炎临床诊断的新方法.
【关键词】 背柱炎 强直性 HLAB27抗原 流式芯片
　　 0引言
　　强直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis， AS)是一种原因不明的以中轴关节慢性炎症为主要表现的全身性疾病，主要侵犯骶髂关节、髋关节、脊柱旁软组织及外周关节等. 该病早期进展较慢，但后期发展较快，很短时间内形成驼背畸形，髋、膝等关节强直，待诊断明确时再予以正确治疗效果较差，故早期诊断尤为重要. HLAB27分子由2条多肽链组成，一条α链或重链，Mr约44 000. 它们与另一条β链或轻链即β2微球蛋白(Mr约12 000)结合共同组成B27分子［1］. 迄今已检出25个HLAB27等位基因(亚型). 可编码23种蛋白质(B2701B2723)［2］. 随着HLA基因分型性技术的成熟和发展，从亚型水平探讨AS的发病机制已成为可能. 　　我们采用的流式芯片技术是近年来新发展的分子生物学研究方法，可以快速准确地对HLAB27的相关亚型进行快速准确的检测，可以进一步深入探讨AS的发病机制，提供临床上早期诊断AS的新方法.
　　1材料和方法
　　1.1材料研究样本为2003/2005年苏北人民医院骨科门诊或病房AS患者(按1997年Englemen提出的诊断标准［3］)外周血，共124（男88，女36）例，全部为汉族，年龄分布为17~54岁，另有50例正常人门诊样本. 流式细胞仪FACSCalibur及所用HLAB27检测试剂盒均为BD公司产品， Caliper1000微流芯片分析仪来自德国安捷伦公司.
　　1.2方法
　　1.2.1流式细胞方法检测HLAB27① 取专用试管1支，加入mAb 30 μL，再加入肝素50 μL抗凝血，充分混匀后置暗处于l5%～22％ 20 rain. ② 荧光染色后，加入溶血剂2 mL，充分混匀，准确放置暗处10 min. ③ 以1500 r/min离心5 min. 弃上清，用PBS洗涤1次，加入PBS液0.5 mL，混匀，上流式细胞仪分析.
　　1.2.2流式芯片方法检测HLAB27亚型
　　1.2.2.1引物设计HLAB27亚型引物序列为：上游5′CCA CTC CAT GAG GTA TTT CC3′，下游5′GTC TGT GCC TTG GCC TTG C 3′（由上海捷倍恩基因公司合成）.
　　1.2.2.2基因组DNA提取抽取静脉血0.5 mL，EDTA抗凝，盐析法提取DNA，并用紫外分光光度计读取260 nm， 280 nm两个波长下的吸光度检测DNA浓度.
　　1.2.2.3PCR反应PCR反应体系中含0.2 mmol/L dATP双侧引物各0.5 μmol/L，DNA模板0.1 μg，TaqDNA多聚酶1~1.5 U，总体积50 μL，PCR反应在全自动PCR仪上进行，96℃ 30 s变性，65℃ 50 s退火，70℃ 1 min延伸，30个循环，72℃延伸5 min.
　　1.2.2.4流式芯片确定HLAB27亚型扩增产物混匀，取1 μL加入芯片样品孔中，再加入染色胶，将芯片平稳置于Caliper 1000微流芯片分析仪上，应用分析软件读取HLAB27各亚型峰图形.
　　统计学分析： AS患者和正常人两组间的阳性率比较采用χ2检验.
　　2结果
　　2.1HLAB27采用流式细胞技术共检测AS患者外周血124例，结果阳性116（男94，女22）例. 另外还检测正常人外周血50例，仅发现HLAB27阳性1例.
　　2.2HLAB27亚型对所有HLAB27阳性样本应用流式芯片技术，进一步确定HLAB27的亚型. 典型的HLAB27 04， 05亚型流式芯片检测结果见图1A， B. 在124 例AS患者中：HLAB2704亚型阳性68人，占HLAB27阳性总数的58.6%，HLAB2705亚型阳性为48人，占HLAB27阳性总数的41.4%；50例正常人对照组中仅有1例HLAB27阳性，且亚型检测结果为HLAB2704. AS患者组与正常人对照组的HLAB27阳性率有显著性差异（93.5% vs 0.5%， P&<0.05）.
　　3讨论
　　HLAB27是一种Ⅰ类组织相容复合体(MHC)基因即人类白细胞抗原基因，其表达产物即HLAB27抗原分子［4］. HLAB27是第一个被发现的人类某一疾病与一种MHC 分子相关的抗原. 1973由Brewerton［5］报道了HLAB27与AS的密切相关性，这在迄今已知的HLA与疾病的关联中是最强和最典型的. HLAB27传统检测方法为免疫学和血清学技术(微量淋巴细胞毒试验)，现渐为流式细胞技术替代［6］. 我们采用流式细胞技术对临床AS患者和正常人进行研究，所得结果也进一步验证上述这种相关性，在所研究的124例AS患者中，有116例HLAB27阳性，阳性率为93.5%，50例正常人中有1例HLAB27阳性，阳性率为0.5%. 但是，因为普通人群HLAB27阳性率达4%～7%，而AS的患病率仅0.3%左右［7］，即40～70名HLAB27阳性的个体中，只有3名左右可能是AS. AS患者中，还有10%左右HLAB27阴性. 因此单凭HLAB27阳性不能确诊AS，而HLAB27阴性也不能排除AS. 因此进一步研究AS患者HLAB27的亚型分布具有十分重要的临床价值. 　　随着HLA基因分型技术的成熟和发展，从亚型水平探讨AS的发病机制成为可能. 目前的研究显示，不同亚型可表现出对AS的正相关和负相关，所以在亚型水平上对疑为AS的患者作HLAB27检测，对AS的诊断和鉴别诊断具有重要价值［8］. 目前检测HLAB27亚型的主要方法有DNA限制性片段长度多态性分析，PCR单链构象多态性及PCRDNA测序等方法，这些方法通常是结果判读复杂，定量分析困难，不利于临床诊断上的推广普及. 我们采用先进的流式芯片技术，可以快速准确地对HLAB27相关亚型作出分析，但由于抗体的交叉反应，有产生假阳性结果的可能［9］，我们在后面的分型实验中，由于采用灵敏度和特异性更高的PCR加流式芯片方法，从而对第一步的结果进一步加以确定，试验结果证明不存在假阳性. 通常采用基因分型技术鉴定HLAB时，约有1%的样本因DNA抽提失败而致假阴性［10］. 我们在采用PCR加流式芯片方法进行基因分型时，在扩增之前对所有样本DNA都进行了含量检测，避免了因DNA抽提失败而致的假阴性结果.
　　总之，本研究为分析HLAB27阳性AS患者的亚型分布关系提供临床资料，也为进一步深入探讨AS的发病机制以及与HLAB27的确切关系奠定基础，并为临床AS疾病诊断提供辅助性的新方法.

参考文献

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