关于慢性复合应激对大鼠胃幽门HAP1表达的影响

作者：廖义林 廖家万 刘能保 李晓恒

【摘要】 目的：　探讨慢性复合应激大鼠胃幽门内分泌细胞亨廷顿蛋白相关蛋白1（HAP1）表达的变化及其意义. 方法：　大鼠12只随机分为慢性复合应激组和正常对照组. 应激组动物进行6 wk的垂直旋转、睡眠剥夺、捆绑（6 h/d）和夜间光照等慢性复合性应激试验；实验结束后，所有动物采用免疫组织化学和Western Blot等方法检测胃幽门内分泌细胞内HAP1蛋白表达的变化. 结果:　HAP1在大鼠胃幽门主要表达在胃泌素细胞中. 与对照组相比，慢性复合应激组大鼠胃幽门内分泌细胞内HAP1的表达增强（P&<0.05）. 结论：　慢性复合性应激大鼠HAP1在胃幽门胃泌素细胞的表达加强.
【关键词】 慢性复合应激 亨廷顿蛋白相关蛋白1 幽门 大鼠
　　0引言
　　亨廷顿蛋白相关蛋白1（Huntingtinassociated protein 1， HAP1）因与亨廷顿病（Huntingtons disease， HD）基因产物亨廷顿蛋白（Huntingtin， Htt）相互作用而备受关注. 早期研究认为，HAP1是一个脑特有的蛋白质，广泛分布在大鼠脑神经元中，随后的研究显示，HAP1在内分泌系统中也有表达［1］，但其功能尚不明确［2］. 目前还未见有文献报道慢性应激对胃幽门HAP1表达的影响. 我们采用形态学和分子生物学相结合的方法，以多种应激原对大鼠进行长达42 d的慢性复合应激，观察慢性复合应激大鼠胃幽门内HAP1蛋白含量变化，探讨慢性复合应激大鼠胃幽门HAP1表达变化可能的功能意义.
　　1材料和方法
　　1.1材料成年雄性Wistar大鼠(华中科技大学同济医学院实验动物中心提供)12只，体质量200 g左右，将动物随机分为：正常对照组（简称对照组，n=6）；慢性复合应激组（简称应激组，n=6）. 自制应激原：电动垂直转轮旋转器，其上挂载多个小的金属网鼠笼，每笼只置1只大鼠；圆锥形金属网筒捆绑器； 睡眠剥夺水池：长×宽×高为120 cm×120 cm×120 cm，池内水深50 cm，池中有多个立柱，间距10～20 cm，柱顶面积为16 cm2，离水面15 cm，单个大鼠置柱顶上；自控时间的夜间光照器.
　　1.2方法应激组动物每天无规律交替暴露于垂直转轮旋转器上旋转（转速30 r/min，每次20～60 s，间隔4～10 min）、金属网筒捆绑器中捆绑、水池中睡眠剥夺，或夜间间歇性光照4种应激原中，持续6 wk；前3种白天进行，每天6 h；后者晚间进行，光照呈间歇式（每光照1～1.5 h，间隔10～15 min）；正常对照组动物平行常规喂养. 应激42 d后，两组大鼠中各取6只进行灌流固定、取胃幽门，经常规脱水、透明、石蜡包埋后，行连续切片（厚5 μm）. 所有动物均依次间断选取切片，每10张取1张，每个动物共取5张，用于HAP1免疫组织化学染色. 主要步骤：兔抗HAP1多克隆抗体（1∶10000，华中科技大学李和教授馈赠）室温下孵育切片过夜；生物素化羊抗兔Ig G（1∶200，北京中山）室温下孵育1 h；SP（1∶200， 北京中山）室温下孵育1 h. 用抗体稀释液替代兔抗HAP1多克隆抗体作为阴性对照，反应呈阴性. 对胃幽门胃泌素阳性细胞进行计数.
　　统计学处理： 实验数据以x±s表示，用统计学软件SPSS12.0进行统计学分析，两组间均数比较用t检验， P&<0.05为具有统计学意义.
　　2结果
　　2.1动物一般行为变化应激组动物在开始接受复合应激后因恐惧紧张而出现稀便排泄物增多，到实验后期呈现攻击性趋势、警惕性提高和相互打斗等暴躁行为. 应激组动物的体质量增长趋势不明显，增长幅度明显低于正常对照组（P&<0.05，图1）.
　　aP&<0.05 vs对照. (x±s， n=6)
　　图1慢性复合应激对大鼠体质量的影响
　　2.2HAP1免疫组织化学定量分析HAP1的免疫反应产物呈棕黄色细小颗粒，分布在胃泌素细胞中. 与正常对照组比较，应激组阳性细胞增多（图2）. 细胞计数结果显示，与正常对照组(33.8±4.2)比较，慢性复合应激组(39.9±3.1)HAP1的免疫反应细胞明显增多（P&<0.05）. 3讨论
　　HAP1是一个功能尚未完全明了的新蛋白，在脑内分布广泛. 有研究提示，HAP1参与了神经元内物质的运输，与细胞内的分子和细胞器转运以及膜受体的胞吞作用等有关［3-5］. 最近研究显示，HAP1在内分泌系统中也有广泛的表达，如垂体、甲状腺、胰腺、肾上腺、胃幽门等内分泌器官内［1］. 而HAP1在胃幽门内的表达具有何种意义，目前尚未见有明确报道.
　　慢性复合应激，可模拟人们的活动或活动空间受到限制等所引起的应激［6］. 我们的观察到，HAP1免
　　A: 应激；B: 对照.
　　图2HAP1在胃幽门阳性细胞的表达SP ×400
　　疫阳性产物，表达在大鼠胃幽门的胃泌素细胞内［7-8］. 慢性复合应激组大鼠胃幽门内胃泌素HAP1免疫反应阳性细胞多于正常对照组大鼠，表明慢性复合应激可引起大鼠胃幽门HAP1蛋白的表达增加. 胃泌素细胞分泌的激素为胃泌素，属于含氮激素分泌细胞，提示HAP1可能参与了慢性应激调节胃泌素细胞分泌胃泌素的过程.

参考文献

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