关于阿那曲唑对乳腺癌组织c myc表达的影响

【摘要】 目的：探讨阿那曲唑对初次罹患乳腺癌患者癌组织cmyc表达的影响. 方法：在患者知情情况下，行乳腺癌切除术前3 d到1 wk，获取40例患者部分肿瘤组织后，对患者施予阿那曲唑治疗. 手术过程中获取肿瘤组织. 将肿瘤组织研磨后，Western Blot分析乳腺癌组织中cmyc的表达. 同时免疫组化检测乳腺癌组织雌激素受体表达情况. 并用ELISA方法检测患者治疗前后血清中的雌二醇水平. 结果：40例患者中，雌激素受体阳性患者为28例，占70%. 经阿那曲唑治疗后，雌激素受体阴性患者cmyc表达无明显变化（P&>0.05）；雌激素受体阳性患者cmyc表达有显著变化(P&<0.05)，其中23例患者cmyc表达明显降低，2例没有变化，3例升高. 阿那曲唑能够降低所有患者的外周血雌二醇的水平. 结论：对于绝经后的乳腺癌雌激素受体阳性患者，阿那曲唑能够有效地降低癌基因cmyc的表达， 从而降低癌细胞的转移性.
【关键词】 乳腺肿瘤 阿那曲唑 原癌基因蛋白质c myc

　　0引言
　　乳腺癌是临床上妇女最常见的恶性肿瘤之一. 70%乳腺癌细胞膜表面有雌激素或者孕激素受体表达， 为激素敏感性肿瘤［1-2］. 所以近年来，除了传统的化学治疗外，内分泌辅助治疗乳腺癌也得到了长足的进展［3］. 作为新型的辅助治疗药物，阿那曲唑已被证实在降低肿瘤的转移性等诸多方面优于传统的三苯氧胺［4］. 但是在体情况下，阿那曲唑对肿瘤的作用尚不明了. 本研究针对乳腺癌重要的癌基因产物cmyc进行探讨，发现阿那曲唑能够有效地降低乳腺癌细胞cmyc的表达， 从而降低癌细胞的转移性.
　　1对象和方法
　　1.1对象收集200603/200608行乳腺癌手术的绝经乳腺癌患者40例， 中位年龄62 (54~68)岁. 所有患者均签署知情同意书. 按照1 mg/d剂量在术前3~7 d服用阿那曲唑. 阿那曲唑(瑞宁得)为阿斯利康公司产品(1 mg/片). 临床应用方式为口服. 抗雌激素受体多克隆抗体，抗GAPDH多克隆抗体及辣根过氧化物酶标记羊抗兔多克隆抗体均购自DAKO公司. 化学发光检测试剂盒购自Roche公司. 雌二醇（E2）检测试剂盒购自晶美公司.
　　1.2方法
　　1.2.1免疫组化检测乳腺癌组织雌激素受体的表达患者服用阿那曲唑前及手术当中，分别手术获取绿豆大小肿瘤组织，经40 g/L甲醛固定后，常规石蜡包埋，4 mm厚度连续切片，脱蜡至水，30 mL/L过氧化氢溶液室温下作用30 min，用蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min. 于枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0） 80℃孵化10 min. 每张切片加5 mL 100 mL/L山羊血清封闭10 min，滴加50 mL（1∶500稀释）兔抗雌激素受体a链多抗，37℃反应60 min，PBS冲洗3次，每次5 min. 滴加辣根过氧化酶标记二抗溶液，37℃反应30 min，其后用PBS冲洗3次，每次5 min. 滴加100 mL新鲜配制的DAB溶液显色，镜下观察显色反应，显色适度时以自来水终止反应. 苏木精衬染，中性树胶封片，电镜观察.
　　1.2.2Western Blot检测乳腺癌组织cmyc的表达将组织直接研磨后，加入上样缓冲液100℃沸煮5 min. 灌制SDSPAGE电泳胶，将同一份样品等分3份，每份再等分两份后上样，电泳. 用电转移装置将蛋白转至PVDF膜上. 电转移完毕后，取出膜，用TBS洗涤1次. 将膜放入封闭液，4℃封闭过夜. 用封闭液稀释抗cmyc和抗GAPDH mAb至1~10 mg/L，与含有目的蛋白条带膜在室温作用1 h. TBS 洗膜4 次，每次15 min. 按试剂盒说明书稀释酶标记二抗，与膜于室温作用30 min. TBS洗膜4次，每次15 min. 按试剂盒说明书混合发光液A和B，与膜作用1 min后进行X光片曝光. X光胶片曝光后，在激光光密度图像扫描仪上扫描得光密度值. 参照等分样品的GAPDH，进行半定量分析.
　　1.2.3ELISA检测乳腺癌患者血清中雌二醇水平收集患者阿那曲唑治疗前后血清并冻存于-70℃，集中检测前4℃缓慢解冻. 将血清加入试剂盒，37℃作用1 h，PBS洗涤3次，每次5 min. 按试剂盒说明书稀释HRP酶标记二抗，同样37℃作用1 h，PBS洗涤3次，每次5 min. 加入底物，37℃显色15 min后终止反应. 酶标读数仪检测A450 nm值. 每个样品重复3次.
　　统计学处理: 结果以x±s表示， 采用SPSS13.0进行统计分析， 治疗前后比较采用配对t检验. 以P&<0.05为差异有统计学意义.
　　2结果
　　2.1乳腺癌组织雌激素受体的表达免疫组化结果显示，40例患者中，雌激素受体阳性患者为28例，占70%. 光镜下显示阳性细胞核着色阳性（图1）.
　　2.2阿那曲唑对乳腺癌细胞cmyc表达的影响治疗前后，雌激素受体阴性患者cmyc表达量分别为1.02±0.13和0.97±0.11，差异无统计学意义（P&>0.05）；雌激素受体阳性患者cmyc表达量分别为0.79±0.15和0.49±0.21，差异有统计学意义（P&<0.05）. 雌激素受体阳性患者经治疗后，23例cmyc表达量明显降低，2例无明显变化，3例则升高(图2).A: 阴性; B: 阳性.图2雌激素受体阳性患者乳腺癌细胞cmyc表达的Western Blot检测
　　2.3ELISA检测乳腺癌患者血清中雌二醇的含量对比阿那曲唑治疗前后血清中雌二醇的含量，显示阿那曲唑能够显著降低所有患者雌二醇水平. 从治疗前的(4.6±1.1) ng/L降低到(0.9±0.4) ng/L，降低了80.4%，有显著性差异（P&<0.01）.
　　3讨论
　　乳腺癌的内分泌治疗主要包括以下4 种方式: 绝经前妇女采取卵巢去势治疗和抗雌激素治疗，绝经后妇女采用芳香化酶抑制剂治疗和孕激素类药物治疗［5］. 其中， 芳香化酶抑制剂抑制肾上腺、脂肪、肝脏和肌肉中的芳香化酶，从而阻止雄激素转化为雌激素，在绝经后的妇女中，由于卵巢已经失去功能，该转化是雌激素的重要来源［6］. 阿那曲唑是与芳香化酶可逆性结合的非甾体类芳香化酶抑制剂， 新近的临床资料显示其有很好的抑制肿瘤复发和转移的特性［7］. 但并非所有的乳腺癌患者都是雌激素受体阳性，本研究结果则显示临床上大约有70%的患者雌激素受体阳性， 这就造成了临床治疗的差异性.
　　cmyc是重要的癌基因产物，有研究表明，其峰度与乳腺癌的预后，转移及恶性程度密切相关［8］. 雌激素受体存在于细胞质膜上，有两个亚单位， ERα和β， 分别属于核受体的类固醇/甲状腺激素超家族，与配体结合后，其构象发生变化，并伴随一系列事件的发生，导致雌激素调控基因的转译速率发生改变. 这些事件大概包括受体的二聚化，受体DNA反应，和其他协同激活因子或转译因子间的反应以及形成启动复合物. 雌激素是甾体类激素中间体复杂合成过程的最终产物，该过程需要一个关键酶-芳香化酶. 芳香化酶负责雌激素合成的最后一个步骤，即将雄激素（雄烯二酮和睾酮）转化成雌激素（雌酮和雌二醇），该过程可被瑞宁得选择性抑制. 芳香化酶属于细胞色素P450系统，参与醛固酮、皮质醇和雄激素的生物合成，常见于外周组织，如肌肉、脂肪、肝脏和乳腺肿瘤内部.

　　本研究发现阿那曲唑可以抑制所有患者的雌激素水平，说明这种抑制是非特异性的. 由于阿那曲唑对雌激素转化的抑制作用，导致雌激素受体阳性的肿瘤细胞缺乏上游的雌激素刺激， 从而降低cmyc的转录和表达水平. 而对于雌激素受体阴性的患者来说，雌激素转化的抑制则是没有意义的，这在临床上有重要的治疗指导意义，也从另一方面说明阿那曲唑治疗只对雌激素敏感的患者有效. 但是在部分雌激素受体阳性患者中，尽管阿那曲唑可以降低雌激素水平，但是对cmyc的表达影响不大，甚至有部分患者cmyc的表达水平还有所增高， 这些都显示乳腺癌的发病机制是比较复杂的. 对于那些反应比较低的患者，尚需要进行其他的分子靶点分析，以期达到配合其他药物对肿瘤组织有效地抑制和治疗效果.

参考文献

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