关于雄激素受体在不同激素依赖特性的前列腺癌细胞株中的表达及活性

论文代写网： 【摘要】 目的：探讨雄激素受体（AR）在前列腺癌激素依赖特性转变过程中的可能作用. 方法：分别应用Western Blot和RTPCR法检测四种前列腺癌细胞株（LNCaP，C4，C42及C42B）的AR蛋白表达差异和转录活性差异状况， 并初步分析其在前列腺癌雄激素依赖特性转化过程中所发挥的作用. 结果：AR在雄激素依赖的低转移性细胞株LNCaP中的蛋白表达量和转录活性最低，同时AR在雄激素非依赖的高转移性细胞株C4， C42及C42B细胞株中的蛋白表达、转录活性却逐渐增高. 结论：AR在雄激素依赖特性和转移潜能不同的前列腺癌细胞株之间确实存在着有意义的差异表达，而这种表达差异可能在影响前列腺癌激素依赖特性转变过程中发挥重要作用.
【关键词】 雄激素受体 前列腺肿瘤 素非依赖性
　　0引言
　　恶性程度低的部分前列腺癌（prostatic carcinoma， PCA）患者可以长期带瘤生存，部分恶性程度高的PCA患者却进展很快、广泛转移，尤其易对抗雄激素治疗产生耐受特性，是导致复发和死亡的主要原因. 对于雄激素非依赖前列腺癌（androgen independent prostate cancer， AIPC）的发生原因，尽管已做了大量基础与临床的研究工作，但是确切分子机制目前仍然不清楚. 因此我们采用能模拟PCA临床进展过程的细胞模型，即LNCaP/C42细胞系列（包括C4，C42，C42B细胞），检测低转移的雄激素依赖型前列腺癌细胞（ADPC）细胞LNCaP和高转移的AIPC C4，C42，C42B细胞中雄激素受体(androgen receptor， AR)的蛋白表达和基因转录活性，旨在探讨AR在PCA细胞雄激素依赖特性转变过程中可能的作用.
　　1材料和方法
　　1.1材料人Pca细胞株LNCaP及其亚细胞系C4，C42和C42B细胞均由美国Emory大学Leland WK Chung教授馈赠. Trizol购自Invitrogen公司. RT及PCR试剂盒均购自Fermentas公司. 小鼠抗人AR mAb购自美国Santa Cruz公司，兔抗人βactin mAb及辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠和羊抗兔二抗均购自武汉博士德公司.
　　1.2方法
　　1.2.1细胞培养用含100 mL/L胎牛血清（杭州四季青公司）的Tmedium（美国Gibco公司）在37℃， 50 mL/L CO2的孵箱内培养，以1.25 g/L胰酶和0.2 g/L EDTA的混合液消化传代.
　　1.2.2RTPCR提取细胞总RNA［方法参照分子克隆指南（第3版）］. RTPCR反应： 0.5 mL离心管中加入4 μg总RNA，Oligo (dT) 18 μL，加DEPC处理水至12 μL，70℃温浴5 min后取出冰浴，依次加入5×反应缓冲液4 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，RNA酶抑制剂1 μL (20 U)， 37℃温浴5 min后，加1 μL (200 U) MMuLV逆转录酶，混匀后42℃温浴1 h，70℃灭活10 min. PCR反应体系为2×反应缓冲液12.5 μL、引物正反义链各0.5 μL、模板DNA 2 μL以及DEPC处理水9.5 μL至终体积25 μL. AR的反应参数：93℃ 3 min，进入循环，93℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s；29个循环，72℃ 10 min. βactin的反应参数：94℃ 3 min，进入循环，94℃ 45 s，58℃ 45 s，72℃ 45 s；29个循环后，72℃ 5 min. AR引物正义链：5′ GCAATCATTTCTGCTGGCGCA 3′，反义链：5′ AGCTACTCCGGACCTTACG 3′. βactin正义链：5′ GTGGGGCGCCCCAGGCACCA 3′，反义链：5′ CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC 3′. 引物由上海生物工程公司合成.
　　1.2.3蛋白提取将处于对数生长期且状态良好的细胞， 用10 g/L NP40细胞裂解液（10 g/L NP40，pH 7.4 Tris碱50 mmol/L， NaCl 150 mmol/L， 1 g/L SDS， 5 g/L脱氧胆酸盐，200 mg/L苯甲基磺酰氟，50 mg/L抑肽酶）裂解细胞，震荡混匀. 4℃静置30 min，然后在4℃条件下，2 0627 g离心10 min，提取上清总蛋白. 用考马斯亮蓝G250定量，最后100℃沸水中变性10 min.
　　1.2.4Western Blot按每孔20 μg上样， SDSPAGE 90 V电压下分离，再用25 V电压将凝胶上的蛋白半干转至硝酸纤维素膜（NC膜）上. 5 g/L脱脂奶粉将膜封闭2 h后，加入一抗（小鼠抗人AR，稀释度为1∶300；兔抗人βactin，稀释度为1∶3000），4℃孵育过夜，TBS充分漂洗后加入辣根过氧化物酶标记的二抗（稀释度为1∶3000）孵育2 h. 化学发光显色.
　　2结果
　　2.1AR在不同雄激素依赖特性细胞株中的蛋白差异表达情况Western Blot显示AR在LNCaP， C4， C42及C42B细胞中均有较高程度的表达（图1），随着肿瘤细胞的恶性程度增强而表达逐渐增强. 这表明，AR在LNCaP，C4，C42及C42B细胞中的表达可能与细胞适应低水平雄激素环境的能力有关系.
　　2.2不同雄激素依赖特性细胞株中的AR基因转录活性分析AR mRNA在激素依赖特性及转移特性不同的LNCaP，C4，C42及C42B细胞中均可被扩增出来，尤其在雄激素非依赖的高转移特性的细胞系C4，C42，C42B中，转录活性更高(图2). 这表明，AR转录活性增强可能与细胞的雄激素非依赖特性机制有关.
　　图1AR在不同雄激素依赖特性细胞株中的蛋白差异表达
　　图2不同雄激素依赖特性细胞株中的AR基因转录活性分析
　　3讨论
　　雄激素非依赖性PCA的确切发生机制尚未完全明了，关于PCA雄激素敏感性改变的原因，主要有几个假说［1-2］. 这些研究说明了PCA激素依赖特性转变机制的复杂性，此外，组织学标本的体内生物学差异，或非亲本细胞株之间的基因差异等因素也存在影响. 因此，对于PCA生物学特性转变机制的研究，由于缺乏准确模拟其临床进展特点的细胞和动物模型，从而限制了相关研究的进展.
　　LNCaP细胞是ADPC细胞，几乎无侵袭及转移能力，而且在裸鼠体内成瘤率低. 而LNCaP细胞亚系C4， C42， C42B为AIPC细胞，不但可以在去势裸鼠体内生长成瘤，而且局部侵袭及远处转移能力逐渐增强，尤其是特异性骨转移倾向逐渐明显，为研究Pca的进展机制建立了很好的研究平台［3］.
　　我们应用同一亲本起源的LNCaP/C42细胞模型，观察AR在其中的蛋白表达和基因转录活性，发现二者均随着细胞激素依赖特性改变和转移能力增强而增强. 我们认为，这与PCA细胞适应低水平雄激素环境密切相关，AR表达及转录水平的升高，使AR对低浓度雄激素的敏感性增强，PCA细胞失去对正常生长的调控，在极低浓度雄激素环境下仍能无限增殖，这可能是AIPC产生的重要机制之一.
　　过去认为AIPC是由于AR表达蛋白下调或缺乏引起，但是，Brown等［4］检查18例AIPC的AR和9例原发肿瘤相比较，应用FISH分析发现9/18的HRPC有AR基因扩增，而未治疗的原发前列腺癌中无AR基因扩增，提示AIPC有AR基因的扩增. 国内张勇等［5］采用RBA法研究证实，AIPC的AR表达量高于ADPC的AR表达量. 甘道举等［6］用免疫组化两步法检测15例国人AIPC发现，1例(1/15) AIPC无AR表达，其余14例(14/15) AR表达均为强阳性，AIPC的AR染色的平均光密度值较ADPC升高，表明AIPC有更高的AR基因扩增率. Chen等［7］还证实，30 %的AIPC存在AR基因扩增及AR转录水平升高. 这与我们的研究结果类似. 　　研究发现，AR转录除可以被雄激素受体信号途径激活外，还可以被该路径以外的旁路所激活. 生长因子（如IGF， EGF， TGFα， KGF）， LHRH， TH， IL6等调控失衡后，均可通过自分泌或旁分泌的方式直接或间接改变AR的磷酸化状态，激活AR的转录［8］. 研究表明，多数生长因子信号传导都是经过一系列酪氨酸磷酸化过程实现的，在这个过程中，有丝分裂激活蛋白激酶(MAPK)磷酸化激活显得尤为重要，ADPC和AIPC细胞生长和增生都涉及到MAPK的磷酸化激活. IL6可通过MAPK和STAT3激活AR［9］，无需雄激素的参与. 这些生长因子通过旁路反常激活AR可能为雄激素非依赖细胞提供了逃避正常生长调控的途径，可能是激素治疗失败的又一个原因. 从这个角度来看，我们的研究结果可以被理解为：AR表达及转录水平的升高是细胞为接受雄激素以外的其他细胞因子信号作准备，通过变异的AR信号传导途径激活PCA细胞的增殖和进展. 本研究进一步确认了AR转录增强和表达增高与PCA的激素依赖特性转变之间具有密切的联系.

【参考文献】
［1］ So A， Gleave M， HurtadoCol A， et al. Mechanisms of the development of androgen independence in prostate cancer［J］. World J Urol， 2005，23(1):1-9.

［2］ De La Taille A， Vacherot F， Salomon L， et al. Hormonerefractory prostate cancer: A multistep and multievent process［J］. Prostate Cancer Prostatic Dis， 2001， 4(4): 204-212.

［3］ Rubin J， Chung LW， Fan X， et al. Prostate carcinoma cells that have resided in bone have an upregulated IGFI axis［J］. Prostate， 2004，58(1):41-49.

［4］ Brown RS， Edwards J， Dogan A， et al. Amplification of the androgen receptor gene in bone metastases from hormonerefractory prostate cancer［J］. J Pathol， 2002，198(2):237-244.

［5］ 张勇，陈炜，胡笑克，等. 激素难治性前列腺癌组织中雄激素受体蛋白表达的研究［J］. 癌症， 2003， 22(1): 95-97.

［6］ 甘道举， 江军， 陈善勤， 等. 激素难治性前列腺癌组织中雄激素受体蛋白表达的研究［J］. 临床泌尿外科杂志， 2006， 21(4): 279-281.

［7］ Chen CD， Welsbie DS， Tran C， et al. Molecular determinants of resistance to antiandrogen therapy［J］. Nat Med， 2004， 10(1): 33-39.

［8］ Richter E， Srivastava S， Dobi A. Androgen receptor and prostate cancer［J］. Prostate Cancer Prostatic Dis， 2007， 10(2):114-118.

［9］ Ueda T， Mawji NR， Bruchovsky N， et al. Ligandindependent activation of the androgen receptor by interleukin6 and the role of steroid receptor coactivator1 in prostate cancer cells［J］. J Biol Chem， 2002， 277(41): 38087-38094.