【摘要】目的 探讨紧密连接蛋白ZO-1在创伤性脑损伤中的变化及意义。
方法 大鼠随机分为对照组和脑损伤组(0.5h、1h、3h、6h、24h)，参照Feeney’s的自由落体致伤法，制作大鼠顶叶局灶皮质挫裂伤模型。应用伊文氏兰(Evans Blue)法测定伤后不同时间点损伤灶皮层脑组织中EB含量；应用Western blot法检测损伤灶脑微血管内皮细胞紧密连接相关蛋白ZO-1的表达水平。
结果 损伤灶皮层中EB含量在伤后1-6h明显增多，高峰期在3h。Western blot结果显示损伤后1-6h，ZO- 1表达水平较对照组显著降低（p&<0.05），3h最明显，24h与对照组无显著性差异。
结论 脑缺氧缺血时发生脑水肿，可能与ZO-1的表达减少有关。
【关键词】 创伤性脑损伤 血脑屏障 ZO- 1
【Abstract】Objective To explore the changes of tight junction proteins ZO-1 after Traumatic Brain Injury Methods Rats were randomly pided into Control group and Brain-injury group(0.5h、1h、3h、6h、24h) Brain injury animal modes were established according to Feeney’s method. Evans Blue (EB) measurement in cortex was performed to determine the content of EB in damaged cortex at different time after injury， and the protein expression of ZO-1 in microvessel endothelial cells was determined by Western blot. Results The content of EB in damaged cortex was increased obviously at the time point of 1 to 6h after injury. The extravasation peak course was at 3h after injury. Western blot revealed that the expression of tight junction (TJ) associated with protein ZO-1 was significantly decreased at the time point of 1 to 6h after injury. (P&<0.05). and 3h was prominent. Compared with Control group， there was no significant difference in the 24h group.
Conclusion The decreased expression of ZO-1 may play an important role in the formation of brain edema after Traumatic Brain Injury.
【Key words】 Traumatic brain injury Blood-brain barrier ZO-1
随着国民经济和交通运输的发展，创伤性脑损伤(Traumatic Brain Injury， TBI)发病率逐年升高，其早期病理改变之一为血脑屏障(blood brain barrier， BBB)通透性增高引起的血管源性脑水肿。紧密连接（tight junction， TJ）是维持BBB完整性的重要因素，研究表明，紧密连接蛋白-1（zonula occluden-1， ZO-1）是第一个被确定的紧密连接相关蛋白，它是连接跨膜蛋白（如occludin 和claudin-5）和细胞骨架蛋白actin的桥梁[1]，是构成TJ的重要组成部分。目前，关于ZO-1在创伤性脑损伤后的动态表达研究甚少，本文旨在探讨大鼠创伤性脑损伤后不同时间点血脑屏障通透性及ZO-1表达水平的变化，以期进一步阐明脑外伤导致的BBB通透性增加的分子机制，同时为临床TBI的治疗提供新的思路。
1. 材料与方法
1.1材料与试剂 EB粉末(AMRESCO， 美国)，二甲基甲酰胺(AMRESCO， 美国)，、鼠抗ZO-1抗体（Chemicon公司）、小鼠抗β-actin单克隆抗体(Santa Cruz公司)，山羊抗小鼠辣根过氧化物酶标记的IgG抗体(北京中山生物技术公司)。成年SD大鼠(雄性和雌性各半)，体重200～250g，由沈阳医学院实验动物中心提供。大鼠随机分为6组，分设为对照组、脑损伤组(0.5h、1h、3h、6h、24h)，每组8只。
1.2方法
1.2.1制作SD大鼠脑挫裂伤模型：参照Feeney’s自由落体致伤法[3]制作大鼠大脑顶叶局灶皮质挫裂伤模型。大鼠术后2～8h均恢复饮食。每个时间点8只，对照组8只大鼠未致伤。
1.2.2脑外伤大鼠血脑屏障通透性的测定
BTB的通透性可用伊文氏兰(Evans blue，EB)的渗出量定量估计。简单的说，大鼠均于处死前1h股静脉注射用生理盐水配制2％EB(2mg/kg)，测定伤后0.5h、1h、3h、6h、24h皮层脑组织中EB的含量。取脑前，经左心室灌注肝素化生理盐水，直至在右心耳处流出无色液体为止。断头后取伤灶周围脑组织并称重，而后放入甲酰胺(1ml/100mg)60℃孵育24h。在分光光度计上测定620nm处的吸光度，根据用一系列稀释度EB的光密度值制作的标准曲线计算染料含量。
1.2.3Western blot法检测ZO-1表达水平
采用15%葡聚糖梯度离心法提取脑组织的微血管段。微血管段中加入裂解液，在超声粉碎仪上破碎离心提取上清液(细胞膜裂解产物)用于检测ZO-1表达。用考马斯亮蓝G-250结合法进行蛋白定量。等量蛋白经12%SDS-PAGE分离后，电转移到硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉中4℃封闭过夜，分别用小鼠抗大鼠ZO-1抗体(1:300)、和小鼠抗β-actin单克隆抗体(1:1000)与硝酸纤维素膜室温孵育2h；经相应二抗(1:4000)室温孵育2h后，用增强的化学发光法检测免疫复合物表达。采用计算机软件对蛋白条带进行扫描，计算各条带整合光密度值(IDV)。结果以ZO-1/β-actin的IDV比值表示。
1.3统计学分析
用SPSS13.0软件进行数据处理，结果均数±标准差( ±SD)，组间比较用单因素方差分析，P&<0.05为差异有统计学意义。
2.1脑外伤对大鼠血脑屏障通透性的影响
伊文氏兰试验检测脑外伤后不同时间点(0.5h、1h、3h、6h、24h)血脑屏障通透性的变化，发现不同损伤时间均可使损伤灶皮层组织蓝染，其中3h蓝染区面积最大，而对照组未见蓝染。
与对照组(4.20±0.42μg/g)相比，损伤灶皮质中EB含量脑损伤后在1h、3h和6h组显著增加(34.72±3.17μg/g， 86.23±6.73μg/g， 46.35±4.47μg/g， respcctively， p&<0.05)，而在0.5h组(6.78±2.62μg/g)和24h组(5.49±1.86μg/g)无显著性差异。2.2Western blot法检测ZO-1的表达
在损伤后0.5h组(1.94±0.13) ZO-1有较高的表达，与对照组(2±0.13)相比差异无统计学意义(P＞0.05)；而脑损伤1h后，损伤灶微血管中ZO-1的蛋白表达水平开始降低(1.25±0.12)，（P&<0.05），在损伤3h时(0.51±0.12)降低最明显（P&<0.01），而后逐渐增加，6h(1.15±0.14)（P&<0.05），在24h时(1.87±0.12)基本恢复到对照组的水平，无显著性差异(P＞0.05)。(如图1)所示。)
图1 Western blot法检测脑损伤后不同时间点ZO-1的表达水平
Fig.1 Expressions of ZO-1 detected by Western blot.*P&<0.05 and **P&<0.01 vs. control group.
3 讨论
我们的研究证明创伤性脑损伤后血脑屏障的通透性先逐渐增加，损伤后3h通透性最大，而后通透性逐渐减小，至24h时基本恢复正常。在BBB通透性增加的同时，紧密连接相关蛋白ZO-1的表达水平下调，损伤后3h达到最低值，24h时基本恢复正常。上述结果提示，创伤性脑损伤可能通过下调紧密连接相关蛋白ZO-1的表达水平，开放紧密连接，增加血脑屏障的通透性。
创伤性脑水肿的发生机制十分复杂。血脑屏障通透性增高是导致伤后病灶周围脑水肿的主要原因，血脑屏障由基膜、周细胞、星型胶质细胞终足和脑内皮细胞组成，其中存在于相邻内皮细胞间的紧密连接在维持血脑屏障的结构和功能中起重要作用，它可以限制亲水性物质和大分子物质在细胞旁的扩散[3]。紧密连接主要由跨膜蛋白、胞质附着蛋白和细胞骨架蛋白组成，已经确定的几个组成紧密连接的跨膜蛋白包括occludin、claudins 和黏附连接分子；胞质附着蛋白ZO-1、ZO-2、ZO-3 和cingulin[4]。其中，ZO-1分布于多种上皮细胞和内皮细胞的闭锁小带中，它可以敏感地反应出病理情况下屏障的损害，是检测内皮细胞屏障结构和功能的良好指标[5]。这些紧密连接相关蛋白彼此之间存在多重联系，不仅维持紧密连接的完整性，而且为脑内皮提供结构支持，如果这些蛋白发生紊乱将会直接影响紧密连接的完整性，进而改变血脑屏障的功能。我们的结果显示，创伤性脑损伤后紧密连接相关蛋白ZO-1的表达水平减少，在损伤3h时表达水平最少，而后逐渐恢复，24h时基本恢复到损伤前水平，这一结果与伊文氏兰渗透评估实验的结果相一致，ZO-1表达减少后则会引起occludin等跨膜蛋白从细胞骨架上解离，也可使occludin封闭细胞旁缝隙的能力缺失，引起紧密连接开放。提示创伤性脑损伤可能通过下调紧密连接相关蛋白ZO-1的表达水平，开放紧密连接，通过细胞旁途径增加血脑屏障的通透性，引起血管源性脑水肿。对这一问题的深入研究，将可能为临床治疗TBI提供新的途径。
参考文献
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[1]Feeney DM， Boyeson MH， Linn RT， et al. Response to cortical injury: Methodology and local effects of contusions in the rat. Brain Res， 1981， 211:67-77
[2]Bernacki J，Dobrowolska A，Nierwińska K，et al. Physiology and pharmacological role of the blood-brain barrier. Pharmacol Rep， 2008， 60(5):600-622
[3]BallabhP，BraunA，NedergaardM. The blood-brain barrier：an overview. Structure， regulation， and clinical implications. Neurobiol Dis， 2004(1)， 16:1-13.
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