植物微生态制剂发酵工艺及其质量控制

　　　　　　作者：穆燕魁 何娟 周正 周巍 吴涛

　　摘要植物微生态制剂作为防治设施蔬菜连做障碍的一种有效手段，以效益高、作用广泛、无残留污染等特点而受到世界各国广泛的重视，成为当前研究与开发的热点。然而由于目前我国发酵工艺水平落后，市场监管制度不健全，导致我国植物微生态制剂产业的发展受到限制。该文从植物微生态制剂发酵工艺和产品质量控制出发，简述了现阶段我国植物微生态制剂工业的现状、存在的问题和对策。
　　关键词植物微生态制剂;发酵工艺;质量控制;现状;问题;对策
　　AbstractAs a method of effectively controlling continuous cropping obstacles of protected vegetable，the vegetable microecological preparation with the characters of wide effect，low cost，little residual contamination and so on，widely concerned by the world，it has become a hot spot in research and development. But Because of the backward in fermentation process level and the imperfections in market supervision system nowadays，the development industry about vegetable microecologicalpreparation has been limited.In view of the fermentation technology and the production quality control of producing vegetable microecological preparation，the present situation，existing problems and coutermeasures about the industry of vegetable microealogy preparation at present in China were expounded.
　　Key wordsvegetable microecology preparation;fermentation process;quality control;present situation;problems;countmeasures
　　
　　微生物活菌制剂又称微生态制剂，是从人类、动物、植物体内分离的有益微生物经特殊工艺制成的只含活菌或包含活菌及其代谢产物的制剂[1]。有益微生物通过作用于生物体表或体内，调节生物体固有微生物的比重和平衡，从而达到保健、增产和改良品质等作用[2]。微生态制剂以其无副作用、无残留污染、不产生抗药性等优点，逐步成为世界各国研究与开发的热点。1986年，我国陈延熙教授[3]首次提出“植物微生态学”概念，为应用微生态防治植物病害奠定了基础。1992年克洛珀[4]提出了“植物内生细菌”(Endophyticbacteria)概念，进一步促进了植物微生态研究与应用的发展。目前，国内外已经研制出一批效果显著的植物微生态制剂，应用的微生物菌种涉及假单胞菌、芽孢杆菌、链霉菌、木霉等属、荧光假单胞菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及海洋放线菌MB—9、海洋芽孢杆菌等20多种[5-10]。
　　植物微生态制剂主要通过功能微生物的生物占位、生物拮抗、免疫激活等机制达到控制病害的目的，因此活菌数量和功能代谢产物的效价是影响微生态制剂应用效果的关键。而发酵工艺则是制约产品质量、使用效果和成本的关键，该文就植物微生态制剂发酵工艺及其质量控制的现状、存在的问题和解决途径进行探讨。
　　1生产工艺
　　1.1传统生产工艺
　　目前，微生态制剂的生产主要包括液体深层发酵和固体发酵2种工艺[11]。
　　(1)液体发酵工艺。液体发酵工艺一般采用传统的液体发酵罐进行深层液体培养，发酵好的菌液直接装瓶作为成品，或经过浓缩、吸附、干燥制得固体菌剂，采用可湿性吸附剂可制成可湿性粉剂。因液体深层发酵工艺和设备已经十分成熟，根据发酵微生物的生物学特点和发酵特性，可方便获得较为理想的发酵工艺。液体深层发酵具有染菌机会小、易于规模化生产等特点。但是用于活体微生物制剂的发酵生产，如果直接制成液体制剂，具有不宜储运、货架期短、难以规模推广等缺点。工业生产上曾尝试利用液体发酵生产芽生孢子，而研究表明，芽生孢子活力低、不耐贮藏，难以应用于实际[12]。如果制备固体制剂，则工艺繁琐，生产成本高，废液排放污染环境。
　　(2)固体发酵工艺。固体发酵是指利用自然底物做碳源及能源，或利用惰性底物做固体支持物，其体系无水或接近于无水的发酵过程[13]。固体发酵过程产生的代谢产物可作为制剂组分应用，不仅减少了废物排放，还可提高产品的使用效果;而且固体发酵的孢子特性明显好于液体深层发酵的孢子，对干旱条件更具抗性，在干燥的环境中更稳定。但缺点是易污染、产量低、难以规模化生产，仅适用于好气微生物的发酵生产。为克服固体发酵工艺的弊端，国内外已开始注重固态生物反应器的研究与开发，在小规模发酵罐研制方面已取得突破并进行商业化运作，这为农用微生态制剂、酶制剂、发酵饲料等的规模化和产业化开发带来了曙光。
　　1.2新型生产工艺
　　(1)液固两相发酵工艺。首先采用液体深层发酵工艺快速生产出大量菌丝或孢子，再接种到密闭固体发酵罐中进行固体发酵，使菌体在近自然环境状态中生长、产孢[14]。发酵产物经低温干燥、粉碎，即得到成品。该项工艺结合了液体深层发酵和固态发酵，充分发挥了两者的长处，又避免了两者的缺点。这种密闭接种方法不易染菌，质量稳定，生产上便于管理，且种子培养周期短，发酵产物活力高。这种工艺的技术难点在于液体种子与固体培养基的衔接，需通过试验将液、固培养基和液、固培养条件合理衔接，以达到最佳效果。
　　笔者以链霉菌S506为菌种，将液-固结合发酵与传统固体发酵进行比较，结果表明:种子制备时间缩短了72 h，且菌体浓度达到98亿cfu/mL;在固体培养基中加入增效物质M后，发酵延滞期较短，且发酵周期大幅度缩短，产物活菌浓度可达到100亿cfu/g以上[15]。
免费论文下载中心 　　(2)分段培养。最佳的工艺条件对菌体量和芽孢的生产是不同的。在菌体生长阶段采用如补料发酵等高密度的培养方法可提高菌群密度。采用2阶段策略，在第1阶段处于菌体量生产的最佳环境中，刺激产生更多的菌体;第2阶段，在有助于芽孢形成的最佳操作条件下形成芽孢。通过采用这种策略和最佳的实验条件，菌体(Bacillus coagulans RK-02)增加了大约55%，芽孢在干菌体中达到10~1 000亿cfu/g[16]。
　　(3)对复合菌株的产品，通过正交试验确定最佳配比。将各菌株设不同比例，按正交试验表进行组合，然后用试验检验效果。
　　(4)采用细胞生物量的检测。目前国外许多微生态制剂己广泛采用快速菌检技术-生物发光分析，利用菌种体内ATP与荧光素酶反应发光，其光强与ATP含量成比例，通过光强测定来确定菌种数量。
　　2植物微生态制剂的质量控制
　　生产植物微生态制剂的过程中，应严格遵守国家标准，如有效活菌数≥1亿cfu/g(固体制剂)或≥2亿cfu/mL(液体制剂);霉菌杂菌数≤300万cfu/g(固体制剂)或≤300万cfu/mL(液体制剂);保质期≥6个月(固体制剂)或≥3个月(液体制剂)等。为了保证制剂的质量，生产中要注意以下几个方面:
　　2.1筛选优良菌株
　　菌种(株)是维系微生态制剂生命力的关键因素，是微生态制剂的质量保证，是品质控制中最重要的指标。优良的菌种应具备3个条件:一是微生态制剂产品应标明所用菌种的所属、种名和菌号等[17];二是对植物无毒副作用，对土壤不污染;三是菌种具有较稳定的生物学、遗传学特征，在使用和贮存期间应保持稳定和活菌状态。
　　2.2发酵工艺最佳化
　　活菌浓度是评定产品质量的一个关键指标。目前，我国微生态制剂行业生产的产品存在有效活菌浓度低、杂菌率偏高、有效期短等诸多问题，严重影响了市场的开拓和农民使用的积极性。还有些产品虽然开始有较高的活菌数，但由于产品中休眠体少，致使产品质量迅速下降，影响使用效果。这就要求在培养过程中要通过工艺和配方的优化，获得较高的产孢率。如选取合适的碳源，降低发酵培养基中的有机氮源含量，添加适量的Mn2+[18]，将芽孢接种到培养基中活化培养，使之得到有效地提纯和复壮[19]。这些对提高菌数和产孢率均有显著的影响。对于不产芽孢和孢子的菌种，要采用合适的载体或保护剂，以保存有效活菌，延长保存期。吴皓琼等[20]研究表明，用糖蜜、麸皮等作为保护剂，对活菌保存有显著效果，且成本低，使用方便，适宜在生产中应用。
　　2.3产品质量检测与监督
　　目前的植物微生态制剂检验标准中一般包括活菌数测定、杂菌检查和安全试验等。活菌数检测常采用血细胞计数板计数的方法，这种方法快捷、简单，但无法排除死细胞的干扰;杂菌检查要求严格无菌以防再污染，给检测带来了不便;有的安全试验需要较长时间，因此开发出便捷、可靠的质量检测方法迫在眉睫。另外，目前市售的品种没有统一的质量检测标准，同一项目规格单位的表示方法不统一，所以应尽快规范植物微生态制剂的质量标准。
　　3存在的问题
　　植物微生态制剂虽然有很多的优点，但在实际生产和应用中仍存在以下问题:
　　(1)生产条件和生产工艺落后，产品质量不稳定。相当多的生产微生态制剂的厂家虽具备了基本生产设备和条件，但需改进的地方还很多，如搅拌设备简陋，干燥、造粒、原材料灭菌等达不到微生物学要求。
　　(2)生产微生态制剂的原料质量不稳定。以液体发酵工艺的吸附材料草炭为例，草炭产量大，但由于草炭加工技术落后和草炭颗粒过大，限制了微生态制剂质量的提高。
　　(3)活菌制剂在生产、加工、运输过程中极易失活，降低了生物活性。
　　(4)活菌进入植物根系微生态环境后，受各种环境条件的制约，不宜生长和定植，致使使用效果不稳定。
　　(5)国家法规不健全，市场混乱。有些厂家将少量发酵的微生物掺到大量的化肥或其他营养基质中，再以“微生态制剂”的名义进入市场推广应用，对判定起主要作用的物质没有做深入的试验，无可靠的证据验证，严重损害了农民的利益。
　　4解决对策
　　微生态制剂具有低投入、高产出、高质量、高效益、无污染等优点，非常符合现代生态农业和农业可持续发展的要求。如何使微生态制剂更好的发挥功效成为现今的热点话题。针对现存问题，在未来的生产和研究中应该着重做到以下几个方面。
　　(1)加强微生态制剂应用的基础研究。多年来，国外许多学者在诸如微生物和寄主间的关系、品种专性和广谱性机制、制品中微生物进入土壤后的制约因素等方面进行了大量的研究。在特定微生物进人土壤后的存活、繁殖、作用机理研究方面，产品质量和剂型改进等领域需加大科研力度。
　　(2)创建植物微生态制剂原料基地，投资建立具有先进设备的原料加工厂，为微生态制剂生产厂家提供高质量原料，才能保证产品品质。
　　(3)亟需研制和生产微生物肥料专用机械设备。专用的植物微生态制剂的生产设备除了包括大型自动化发酵设备，还要有造粒、干燥等辅助设备等。只有专用设备的广泛采用，才能促进我国微生态制剂产业化水平。
　　(4)及早制定相应法规，完善微生态制剂市场制度，加强对企业的监管力度。
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