建立FQPCR定量体系检测新型隐球菌CAP10 mRNA

　　　　　　作者：戴琳孙， 林旎， 陈勇， 江凌　程祖建， 欧启水

【摘要】 目的 建立荧光定量PCR（FQPCR）技术定量检测新型隐球菌（CN）的荚膜相关蛋白10（CAP10）基因mRNA，为新型隐球菌的诊断、预后及疗效判断提供依据。 方法 用逆转录PCR的方法从CN标准株（ATCC34874）中扩增得到CAP10，构建重组质粒标准品pGEMTEasyCAP10，以倍比稀释的标准品制备标准曲线。设计引物和探针，建立FQPCR反应体系并对其重复性、特异性和线性范围进行评价。 结果 成功构建了重组质粒标准品pGEMTEasyCAP10，并用倍比稀释的标准品制备了标准曲线Y=-3.11X+38.84。批内重复性试验CV值为0.31%，批间重复性试验CV值为2.73%。FQPCR体系能特异扩增新型隐球菌，特异性好，该体系的线性范围为101copies/μL～108 copies/μL。 结论 成功建立CN的CAP10 mRNA的定量检测方法；该方法重复性好，特异性强。

【关键词】 细胞荚膜； 隐球菌，新型； 真菌蛋白质类； 逆转录聚合酶链反应； mRNA，信使

新型隐球菌（cryptococcus neoformans，CN）的荚膜相关蛋白10（capsule associated protein 10，CAP10）对荚膜的形成是必不可少的，它在毒力的形成和维持中起至关重要作用[12]。传统的实验诊断项目，如脑脊液（cerebrospinal fluid，CSF）隐球菌计数、抗原测定和培养等手段灵敏度低、耗时长，无法准确评估CN的毒力和活力[3]。本研究拟建立实时荧光定量PCR（realtime fluorescent quantitative PCR，FQPCR）技术检测CN的CAP10基因mRNA，既可为CN的诊断，尤其是毒力和活力的判断提供敏感、特异的定量手段，又可为治疗CN的效果和预后判断提供依据。

1 材料与方法

　　1.1 材料 CN标准菌株（ATCC34874）购自上海第二军医大学附属长征医院皮肤病学研究所；结核杆菌由福州市肺科医院提供，脑膜炎双球菌和金黄色葡萄球菌由本室分离保存；RNA提取Trizol试剂自（美国invitrogen公司）；Reverse Transcription System、Taq DNA聚合酶、缓冲液、dNTP及pGEMTEasy Vecto购自（美国Promega公司）；DNA纯化回收试剂盒、普通质粒小提试剂盒和真菌裂解液及溶壁酶自（北京天根生化科技公司）。

　　1.2 RNA的提取及逆转录反应 取CN标准株及CSF标本离心沉淀物，加入溶壁酶20 μL混匀后37 ℃水浴30 min破壁，离心弃上清，按Trizol RNA提取试剂盒说明书操作抽提RNA。取上述总RNA按试剂盒说明进行逆转录反应，被逆转录的为CN的mRNA。

　　1.3 引物与探针的设计与合成 比对CN 5种血清型（A、B、C、D、AD）CAP10基因，寻找同源序列，用Primer 5设计CAP10特异性引物和探针（5’→3’）：

　　上游：CCAAGCCCCCAAACCTCCCATACA

　　下游：AACGCGTACCATTCATCAAAGCCC

　　TaqMan探针：CCTCTTCTTGTACTCAGCAACGGC

　　TTCGGGCAA

　　探针5'端由FAM标记，3'端由TRAMA标记。引物及探针均由美国invitrogen公司合成并纯化，目的片段大小为175 bp。

　　1.4 标准品的制备 （1）目的DNA片段的制备：PCR反应体系含Mg2＋（25 mmol/L）3 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTP（10 mmol/L）0.5 μL，上下游引物（25 μmol/L）各0.25 μL，Taq聚合酶（5 U/L）0.3 μL，DNA模板3 μL，加灭菌纯水至总体积为25 μL。反应条件为94 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s→56 ℃ 45 s→72 ℃ 45 s，35循环，72 ℃ 延伸7 min。1.5％琼脂糖凝胶电泳(电压60～80 V，电流强度20～30 mA)，检测PCR产物。（2）载体的构建、鉴定和拷贝数的换算：采用胶回收试剂盒纯化回收切下的琼脂糖凝胶上的目的片段，目的片段与质粒pGEM T连接，转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α中， 37 ℃过夜培养，筛选出重组体，提取质粒，扩增，根据电泳结果，重新将重组体培养至LB培养基，37 ℃摇床过夜，纯化质粒，送上海生工公司测序，测吸光度(D)值，根据阿佛加德罗常数(6.023×1023 分子数/摩尔)换算为分子拷贝数。

　　1.5 FQPCR反应体系的建立 （1）标准曲线的制备：利用ABI7000 Sequence Detector仪器在最优化的反应体系及反应条件下，将插有目的DNA的质粒10倍倍比稀释成107，106，105，104，103拷贝数/微升，用作定量标准品制备标准曲线，以此定量未知模板的浓度。（2）FQPCR反应及条件：25 μL体系中包括Mg2＋（25 mmol/L）3.5 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTP（10 mmol/L）0.5 μL，上下游引物（25 μmol/L）各0.25 μL，Taq聚合酶（5 U/L）0.3 μL，荧光探针0.3 μL和1 μL倍比稀释的阳性质粒标准品。反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s→56 ℃ 45 s，35个循环。仪器根据阳性质粒标准品自动绘制标准曲线，并得出样品检测结果。

　　1.6 方法学评价 (1)重复性试验：包括批内和批间重复性试验。以提取的质粒DNA为模板进行重复性检测，批内重复性试验是对同一模板同时进行6次重复测定，批间重复性试验是连续6 d对同一样本进行重复测定。(2)特异性试验：分别取临床上常见的脑膜炎病原体含结核杆菌、脑膜炎双球菌、金黄色葡萄球菌各一份按标准品目的基因片段的方法制备cDNA作为模板，判断扩增反应特异性。(3)线性范围测定：将定量标准品用ddh3O进行10倍倍比稀释，以此作为模板进行FQPCR，得到标准曲线，通过对每一浓度标准品的荧光曲线形状和各浓度荧光曲线的相关性大小，确定检测线性范围。

2 结 果

　　2.1 重组质粒的鉴定 重组质粒中插入的CAP10基因片段进行测序并与BLAST比对，结果显示被测基因片段序列与GenBank报道的完全一致。结果提示，获得了正确的目的基因，同时成功构建pGEMTEasyCAP10重组质粒(图1)。

　　2.2 重组质粒的定量 提取的质粒测其D值，D=0.073，D260=0.068，D260/D280=1.6，计算得质粒DNA浓度为5.0×1012拷贝数/微升。

　　2.3 标准曲线 (1)将重组质粒模板依次稀释成107、106、105、104、103拷贝数/微升浓度梯度，在ABI7000扩增仪上进行扩增反应，得到重组质粒pGEMTEasyCAP10标准品的定量标准曲线Y=-3.11X+38.84（如图2），不同浓度模板拷贝数与Ct值之间有很好的线性关系（r=0.998）。(2)重组质粒pGEMTEasyCAP10标准品的扩增曲线，如图3。横坐标为Ct值，纵坐标为拷贝数.

　　2.4 方法学评价

　　2.4.1 重复性试验 （1）批内重复性试验：对同一模板同时进行6次重复测定，测得Ct值为22.27，22.37，22.22，22.23，22.17，22.20，平均Ct值为22.24，批内CV值为0.31%（图4）。（2）批间重复性试验：连续6 d对同一样本进行定量PCR检测，测得的Ct值为18.5，18.7，19.8，18.8，19.6，19.0，平均Ct值为19.1，批间CV值为2.73%。可见本实验构建的实时荧光定量PCR检测方法具有良好的重复性。

　　2.4.2 特异性试验 FQPCR检测结果，新型隐球菌标准品有荧光曲线增长，而其余孔无荧光曲线增长(图5)。表明该方法具有良好的特异性。

　　2.4.3 线性范围测定 当标准品浓度>108 拷贝数/微升时，扩增曲线不呈典型“S”形，且标准曲线相关性不好，当标准品浓度<101拷贝数/微升时，扩增曲线也不典型，有时因浓度太低甚至无扩增曲线。而在此范围间，扩增曲线均呈典型“S”形，故认为建立的CAP10基因的FQPCR系统的检测线性范围为101～108 拷贝数/微升(图6)。　　横坐标为扩增循环数，纵坐标为荧光强度. 蓝色、红色、绿色、紫色分别为新型隐球菌、结核杆菌、脑膜炎双球菌、金黄色葡萄球菌.

3 讨 论

　　目前CN的实验室诊断主要依据CSF印度墨汁染色、培养及CN抗原测定等，这些方法的阳性率不高、耗时长、无法准确判断CN的活力和毒力。一些文献报道，用PCR法检测CN，但针对的靶基因不是毒力相关基因[4]。长期困扰临床医师的问题是，有的病人CN数目不多，可是其临床症状严重，有的病人CN数量很多，临床症状却较轻。另外CN的数量和病情的转归之间缺乏相关性，使得医师无法判断疗效和预后。

　　本实验以毒力相关因子CAP10为研究对象，建立FQPCR定量检测CN的CAP10 mRNA，可提升CN的诊断灵敏度。由于直接检测决定致病性的隐球菌的毒力，可为疗效观察、预后判断及病情转归的预测提供帮助。此外，实验表明，相对于DNA，已死亡致病菌mRNA不稳定，直接检测致病菌的mRNA能够真实地反应其活力状态。mRNA检测不但可以反应感染局部致病菌的有无还可以判断致病菌的存活状态[56]。

　　本实验将FQPCR法应用于CN荚膜基因CAP10的检测，所建立的定量检测体系有如下特点：（1）特异性强，其他细菌和真菌不对FQPCR反应产生干扰；（2）重复性好，批内重复实验及批间重复实验变异系数均<3%；（3）灵敏度高，该检测体系线性范围为101～108拷贝数/微升，能满足CAP10定量检测需要；（4）操作简便、易行。本实验所使用的Taqman探针是目前常用的荧光探针之一，国内很多生物工程公司都能合成，且整个实验过程包括抽提RNA、PCR反应等，操作都不复杂。

　　此外，FQPCR中的标准品也是该技术能否准确定量模板的基础和关键。本实验获得的pGEMTEasyCAP10重组质粒稳定、纯化方法简单、易于定量测定、易于大量扩增、纯化和保存，是FQPCR中最常使用的定量标准品。因此完全可以满足临床对CN CAP10 mRNA的定量测定。

参考文献

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