肝损伤动物模型研究进展

【关键词】 肝疾病； 毒物， 四氯化碳； 醋氨酚； 疾病模型，动物

肝损伤是各种肝脏疾病的病变结果，对肝损伤的防治目前仍是一个严峻的课题。通过建立实验性肝损伤动物模型，研究肝病的发生机制，筛选保肝药物，探索保肝作用原理，具有重要的现实意义。现将近年来国内外对实验性肝损伤动物模型分类、作用原理、造模方法及其优缺点等研究进展作综述和探讨。

1 化学性肝损伤动物模型

　　1.1 四氯化碳（carbon tetrachloride， CCl4） CCl4导致肝损伤的主要机制目前认为与其自身和自由基代谢产物有关。CCl4代谢产生的自由基进入机体后，在肝脏经细胞色素P450激活，生成三氯甲基自由基和三氯甲基过氧自由基，攻击肝脏细胞膜上的磷脂分子，使得细胞膜、内质网膜发生氯烷化和脂质过氧化，损伤细胞膜、细胞器；还能与膜脂质和蛋白质大分子进行共价结合，影响蛋白质代谢，并且破坏膜结构和功能的完整性，钙离子内流增加，影响细胞正常生理功能，最终导致肝细胞胞质中的可溶性酶渗出，细胞死亡[1]。

　　CCl4所致肝损伤可分为急性和慢性。急性肝损伤：赖力英等应用4 mL/kg CCl4剂量灌胃可诱发SD大鼠急性肝功能衰竭，死亡率达85 %[2]。慢性肝损伤：Zhang等采用2 mL/kg CCl4腹膜内注射SD大鼠，每周2次，持续9周可伴有肝细胞坏死和明显炎症的肝硬化[3]。CCl4导致肝损伤是经典模型之一，能准确反应肝细胞功能、代谢及形态学变化，重复性好且经济。但CCl4同时还损伤动物的心、脾、肺、肾、脑等器官，另外，蒸汽和液体可由呼吸道、皮肤吸收，对人体也有一定毒性，操作时应注意。

　　1.2 α萘基异硫氰酸酯(αNaphthylisot hiocyanate， ANIT) ANIT是一种间接肝毒剂，其主要损害是通过膜脂质过氧化反应，致使肝细胞变性、坏死、胞内血清谷丙转氨酶(ALT）大量溢入血流，同时还导致胆管上皮细胞肿胀坏死，引起毛细胆管增生及小叶间胆管周围产生炎症，从而造成胆管阻塞，形成明显的胆汁淤积，并伴随以点状坏死为主的肝实质细胞损害，产生梗阻性黄疸，出现高胆红素血症和胆汁分泌减少。

　　黄正明等采用ANIT 100 mg/kg灌胃48 h后，ALT、谷草转氨酶(AST)升高明显，尤其是总胆红素升高更明显，成功诱导Wistar大鼠的急性黄疸型肝炎[4]。ANIT诱发大鼠和小鼠的肝损伤模型，可获得多项异常指标，模型复制简便易行，重现性好，ANIT对动物机体氧化自由基反应系统的影响对抗氧化型保肝药物的研究具有重要意义，是退黄药物研究的理想模型，因此可用于筛选和研究新型保肝药及利胆药。

　　1.3 D氨基半乳糖(Dgalactosamine， DGaln ) DGaln是一种肝细胞磷酸尿嘧啶核苷干扰剂，通过竞争生成二磷酸尿苷半乳糖使磷酸尿苷耗竭，导致肝细胞的RNA和浆膜蛋白合成障碍，限制细胞器的再生及酶的生成和补充，使细胞器受损，引起肝细胞变性、坏死；另外DGaln还可以与肝实质细胞膜特异性结合，影响其完整性，引起肝细胞内Ca2+增多，Mg2+减少，抑制线粒体功能，激活磷脂酶，加速氧化自由基的产生，因此Mg2+/Ca2+的比例失调也是DGaln导致肝细胞不可逆损害的因素之一；加上使肝脏谷胱甘肽减少，并激活库普弗释放TNFα引起细胞凋亡[5]。

　　李梅等筛选DGaln造模的最佳剂量，比较DGaln造成的大、小鼠急性肝损伤模型的稳定性，发现DGaln 500 mg/kg诱导的大鼠急性肝损伤模型肝组织形态变化显著且死亡率低，更适用于保肝新药的筛选与评价[6]。DGaln形成的急性肝功能衰竭模型是研究病毒性肝炎的发病机制及有效治疗药物理想的实验动物模型，其优点是该模型的病变仅限于肝脏，不涉及其它器官，症状、生物化学、组织学表现接近人，给药方便，重复性好，终点明确，具有可逆性，不造成环境污染及人体伤害，不需特殊的实验操作保护措施，对肝衰竭、肝性脑病、人工肝支持系统的评价研究有重要价值，但价格昂贵导致应用受限。

　　1.4 二甲基亚硝胺(Dimethylnitrosamine，DMN) DMN是常见的致肝癌剂，它通过微粒体代谢，其中间产物与细胞核酸、蛋白质等结合可造成细胞内大分子损伤，诱发大鼠肝窦壁肝星状细胞的活化，导致过多增多和沉积，引起肝纤维化形成；同时促进窦内皮细胞形成肝窦毛细血管化，加重肝损伤，促进肝纤维化的发展[7]。

　　DMN肝损伤动物模型可分急性肝损伤动物模型和肝纤维化动物模型。急性肝损伤模型：Horn等采用DMN 5 mg/kg剂量诱导亚急性肝毒性[8]。肝纤维化模型：Li等予DMN(10 μL/kg)腹腔注射Wistar大鼠，每周2次，持续4周，成功诱导了肝纤维化模型[9]。DMN所致的肝纤维化大鼠模型病变类似于人类肝纤维化病变，并且肝纤维化形成率高、死亡率低、造模周期短、肝纤维化形成后病变相对稳定等特点，主要用于肝硬化形成的形态学改变、机理、生化指标的异常改变和门脉高压机制的研究，还用于肝硬化向肝癌转化机制的研究[10]。缺点为DMN毒性大，易挥发，排泄物在24 h内含毒物，易污染环境和影响周围人群。

　　1.5 硫代乙酰胺( thioacetamide，TAA) TAA具有直接肝毒性作用，摄入后可经肝细胞内细胞色素P450混合功能氧化酶代谢为TAA硫氧化物，干扰细胞核内RNA转移，影响蛋白质合成和酶活力，增加肝细胞核内DNA合成及有丝分裂，促进肝硬化发展，同时激活肝细胞磷脂酶A2，破坏肝细胞膜，形成肠源性内毒素血症，导致大面积肝细胞破坏，并可使ALT、AST明显增高。TAA小剂量诱发肝细胞凋亡，大剂量导致脂质氧化和小叶中央坏死、损伤程度与TNFγ和内毒素水平正相关，可被羟自由基清除剂缓解[11]。

　　TAA常用于制作急性肝损伤、肝纤维化和肝性脑病模型：王春妍等采用皮下注射TAA 600 mg/kg制作大鼠急性肝损伤动物模型[12]。Wang等采用4%的TAA溶液以0.2 g·kg-1·d-1剂量腹腔注射，每日3次，持续10周制作成大鼠肝纤维化模型，可用于治疗肝硬化药物的研发[13]。TAA致肝损伤模型过程相对简单易行致肝细胞损伤反应好，且具有良好的可行性和重复性、肝纤维化组织接近人类，制备成功率高等优点，常用于制作肝纤维化和急性肝功能衰竭模型。

2 药物性肝损伤模型

　　2.1 醋氨酚(acetaminophen，PAPA) PAPA亦名对乙酰氨基酚、扑热息痛，经体内P450代谢可生成活性中间代谢物N乙酰对苯醌亚胺(NAPQI)，NAPQI具强大的氧化作用，使生物膜系统发生脂质过氧化，干扰细胞内的能量代谢，导致肝细胞变性坏死，同时诱导肝组织细胞中高表达Fas/FasL和穿孔素/颗粒酶，活化细胞死亡程序，导致肝细胞坏死[14]。PAPA引起肝障碍还与肝脏谷胱甘肽含量减少有关。

　　PAPA加热下溶于生理盐水，给小鼠300～500 mg/kg一次性腹腔注射，也可配成质量浓度为2.5%的混悬液经口灌胃，制成急性肝损伤模型[15]。PAPA常用于制作急性肝功能衰竭模型，其诱导的急性肝功能衰竭模型与人急性肝功能衰竭的临床特点、组织学表现相似，是较理想的急性肝功能衰竭模型。PAPA肝损伤动物模型也可用于因各种原因导致谷胱甘肽含量减少而引起肝细胞损伤的治疗药物筛选。赵世锋等对杂种家犬采用多次皮下注射醋氨酚的方法建立急性肝损伤模型有以下特点：具有较好的重复性、可复制性和稳定性；有明显的肝脏损伤特异性对其他重要脏器无损害；对实验人员危害较小[16]。

　　2.2 其他 四环素（Tetracycline）导致肝损伤的机制仍未明确，禄保平等应用四环素10倍剂量（2 250 mg/kg），灌胃18 h成功制得急性肝损伤模型[17]。抗结核药物异烟肼具有肝毒性，禄保平等认为异烟肼的肝损伤机制与其代谢产物乙酰异烟肼和肼二者引起的自由基脂质过氧化反应有密切关系，应用2倍剂量（180 mg/kg）异烟肼灌胃后18 h，成功诱导急性肝损伤模型[18]，由于家兔对异烟肼敏感多选用家兔动物模型，异烟肼引起肝损伤动物模型多用于药物性肝炎的研究。

3 免疫性肝损伤动物模型

　　3.1 卡介苗（bacillus calmetteguerin vaccine，BCG）加脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） BCG的损伤机制可能是小鼠注射BCG后导致多核中性粒细胞或巨噬细胞(肝内库普弗细胞)聚集于肝脏并被致敏，继而用低剂量LPS攻击，促进其释放大量对肝细胞有毒性作用的细胞因子，如白三烯、TNF、IL1和NO等，NO作为自由基，可以与O2－反应生成超氧化亚硝酸阴离子(ONOO－)以及其他自由基引起脂质过氧化造成肝细胞损害[19]。

　　SheaBudgell等以BCG浆液每只0.2 mL（含＞5×106菌）注射小鼠尾静脉，致敏后10 d，再尾静脉注射LPS每只7.5 μg，成功诱导小鼠肝损伤模型[20]。邱英锋等确定BCG菌数5.0×107+ LPS 剂量30 μg/kg联合最佳，能够充分造成大鼠急性肝损伤[21]。BCG和LPS肝损伤动物模型简便易行，且造成的大鼠急性肝损伤与病毒性肝炎发病机制有较大相似，可用于对病毒性爆发性肝炎的研究。

　　3.2 异种血清 异种血清诱导的免疫性肝纤维化其发生机制尚未明确。异种血清腹腔注射法，可选用猪、牛、羊等血清，其中以猪血清最为常用。猪血清每次0.5 mL腹腔注射SD或Wistar大鼠，每周2次，12周后肝内广泛纤维组织增生，假小叶形成，有典型肝硬化表现[22]。异种血清诱导的肝纤维化模型简便、经济、成功率高、病变单纯以及与人类病程相似，但有自愈倾向，造模周期较长，且牛和羊血清引起的动物死亡率较高。

　　3.3 刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA） ConA是植物凝集素，作为一种T细胞丝裂原，有促进有丝分裂的作用，可以激活T淋巴细胞，分泌大量细胞因子，肝实质可见大量淋巴细胞浸润，主要以CD4+T淋巴细胞为主，引起特异性肝损伤[23]。

　　Dawei等研究发现小鼠静脉注射ConA(20 mg/kg)后6～8 h可制成急性免疫性肝损伤模型[24]。李鸿立等采用小鼠尾静脉注射1 mol/L ConA (12.5 mg/kg)，每周1次，连续6周，成功制出肝纤维化模型，常规病理切片HE染色示肝小叶破坏，结构紊乱，肝坏死明显[25]。ConA肝损伤模型特点：制作简便快速，无需预先致敏；有剂量依赖性，肝损害随药物剂量加大而加重；具有肝脏损伤特异性未发现肺、脾、心等肝外器官损伤[26]。ConA肝损伤动物模型对于治疗自身免疫性肝炎的药物筛选具有重要意义。

　　免疫系统在肝炎的发病过程中有重要作用，尤其是慢性肝炎、肝硬化、乙醇中毒性及药物性肝损伤，虽然免疫性肝损伤模型类似于人类肝炎后肝纤维化的形成机制、病理生理过程，但仍有一定差距，主要是由于缺乏病毒复制和肝实质持续损伤的过程，因此此类模型仅有利于从免疫学角度探讨发病机制和评价药物疗效。

　　4 酒 精

　　酒精对肝损害的机制尚未完全阐明，可能是炎症和免疫病理共同作用的结果，蛋白质和各种营养物质缺乏会加重酒精的肝损害。高浓度的酒精引起急性肝损伤产生大量毒性代谢产物和乙醛，并释放肾上腺素引起肝脏血管收缩肝窦内压升高和肝细胞缺氧，导致空泡变性肝细胞溶解坏死[27]。

　　酒精所致肝损伤可分为性肝损伤和慢性肝损伤。急性肝损伤：小鼠或大鼠以50～60 度白酒或体积分数为50%～60%的乙醇一次性经口灌胃4.0～6.0 g/kg，24 h内可成功造成大鼠急性酒精性肝损伤模型[28]。慢性酒精性肝损伤：赵敏等予50%的乙醇灌胃30 d 即可出现酒精性脂肪肝模型，60 d可见肝脏纤维化改变。该造模方法具有肝纤维化出现率高、造模方便、价格低廉特点，而且模型稳定造模方法简单、快速、易于操作，可以进行重复实验，增加样本量[29]。

　　5 其 他

　　缺血再灌注导致的肝组织细胞损伤主要与氧自由基的生成和钙超载有关，主要用于制作急性肝功能衰竭模型以研究肝移植、细胞移植和人工肝治疗效果。另外，营养和代谢性肝损伤模型、寄生虫性肝纤维化模型、感染性肝损伤模型(病毒性肝炎、沙门菌、大肠杆菌等诱发)亦有不少报道[30]。

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