作者：徐林，张凤，周涯，罗军敏，覃明，姚新生
【摘要】 目的用鼠CD25分子胞外段基因疫苗免疫Balb/c小鼠，观察其诱导的体液免疫应答中B淋巴细胞的变化并探讨其意义。方法用pcDNA3.1-CD25胞外段真核表达质粒分别在第0天、第10天和第20天肌肉注射免疫同系Balb/c小鼠，酶联免疫法(ELISA)检测抗CD25胞外段的抗体水平及亚型，FACS检测脾细胞中B淋巴细胞的比例变化及细胞因子IL-4、IL-10和IFN-γ的表达变化。结果与对照组相比，CD25胞外段基因免疫组小鼠血清抗CD25抗体在免疫后逐渐升高，第30天达最高峰;抗CD25抗体主要以IgG1为主;免疫小鼠脾细胞中B细胞的比例变化不显著(P>0.05)，但高分泌IL-4和IL-10(P<0.05)，而低分泌IFN-γ(P<0.05)。结论CD25胞外段蛋白基因免疫中B细胞功能变化显著，这为后续深入研究体液免疫应答在T细胞疫苗中的作用提供了前期实验基础。
【关键词】 CD25分子胞外段;基因免疫;B淋巴细胞;T细胞疫苗
ABSTRACT: ObjectiveTo evaluate the change of B lymphocytes in humoral immune response induced by DNA vaccine encoding mouse CD25 extracellular domain (CD25e).MethodsBalb/c female mice were inoculated by intramuscular injection of pcDNA3.1-CD25e on day 0， day 10 and day 20， respectively. The titers of antibody to CD25e， as well as the class and subclass of antibody， were assayed with indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The percentage of B cells in splenocytes and IL-4， IL-10 andIFN-γ production of B cells were analyzed by FACS. ResultsCompared with that in control group， the titer of antibody specific to CD25e steadily increased and reached the peak on day 30. The antibody specific to CD25e mainly comprised IgG1. The percentage of B cells in splenocytes did not change significantly (P>0.05). IL-4 and IL-10 production of B cells in splenocytes from pcDNA3.1-CD25e immunized mice was higher than that in control group (P<0.05). By contrast， IFN-γproduction of B cells decreased significantly (P<0.05). ConclusionCD25e DNA vaccine effectively induces the change in B cell function and provides foundation for further research on the role of humoral immune response in T cell vaccine.
KEY WORDS: CD25 extracellular domain; DNA vaccination; B lymphocyte; T cell vaccine
T细胞疫苗(T cell vaccine， TCV)作为一种治疗自身免疫病、病毒性疾病、器官移植排斥反应等的重要手段，目前在临床上得到大量的应用[1-3]。已有的研究发现，调节性T细胞和工作型抗原(ergotope)在TCV作用机制中发挥了重要作用[4-8]。然而，在TCV的免疫调节效应中，其诱导体液免疫应答的相关国内外研究仍较少[9]。HERKEL等[10]发现TCV在Lewis大鼠体内可以诱导针对T细胞的IgG抗体。该抗体可以有效抑制T细胞的增殖。陈永良等[11]进一步报道TCV诱导的抗体可以与T细胞膜上多种成分结合。我们在新近的研究中利用小鼠CD25分子胞外段(extracellular domain)的基因免疫成功诱导了针对自体CD25胞外段的抗体，并有效抑制了后续自身免疫性肝损伤的发生[12]。这些研究均提示在TCV诱导的免疫调节效应中，体液免疫反应也发挥了重要作用。因此，本研究中我们进一步观察CD25分子胞外段基因免疫后体液免疫应答中B细胞的比例和功能的变化情况，为后续深入研究体液免疫反应在TCV中的作用及其机制和后续临床推广应用提供基础。
1材料与方法
1.1材料pcDNA3.1-CD25胞外段质粒和DH5α为本实验室保存;CD25胞外段蛋白由本室原核表达并纯化;质粒纯化试剂盒购自TaKaRa公司;HRP标记兔抗鼠IgG抗体购自上海未尔生物技术公司;HRP标记兔抗鼠IgA抗体、HRP标记兔抗鼠IgG1抗体和HRP标记兔抗鼠IgG2a抗体均购自上海未尔生物技术公司;PE标记的抗小鼠CD19抗体购自eBioscience公司;FITC标记的抗小鼠IL-4、IL-10和IFN-γ抗体购自eBioscience公司;细胞固定和穿膜试剂购自eBioscience公司;其他试剂均为分析纯级。
1.2实验动物Balb/c小鼠，H-2d、4～6周龄、雌性，由重庆医科大学实验动物科学部提供，饲养于SPF级环境。
1.3pcDNA3.1-CD25胞外段疫苗肌注免疫小鼠将6周龄Balb/c小鼠分为PBS对照组、pcDNA3.1组和pcDNA3.1-CD25胞外段组，每组12只，均肌注免疫。每次质粒DNA剂量100μg，注射体积100μL，于0、10、20d免疫3次。免疫前收集小鼠血清，-70℃冻存。
1.4ELISA法检测血清IgA和IgG及其亚型以前期原核表达纯化的10mg/L CD25胞外段蛋白包板，4℃过夜;以50g/L脱脂奶粉+PBS封闭，37℃孵育1h，用PBS洗涤3遍;加入100μL 1∶10稀释血清，37℃ 1h，洗3遍;加入100μL 1∶1000稀释的HRP-羊抗小鼠IgG、HRP-羊抗小鼠IgA、HRP-羊抗小鼠IgG1或HRP-羊抗小鼠IgG2，37℃ 1h，洗5遍;加入100μL OPD底物，避光显色7min，加50μL 1mol/L h3SO4终止显色，测A450值。
1.5流式细胞技术检测B淋巴细胞的比例末次基因免疫后7d，常规处死实验小鼠并收集脾细胞，PBS洗涤后以2×106细胞浓度重悬，取100μL细胞悬液，加入PE标记的抗鼠CD19抗体，4℃共育30min，用PBS洗去游离的抗体重悬后用流式细胞仪检测B淋巴细胞的比例变化。同时，加做抗体的同型对照。
1.6流式细胞技术检测B淋巴细胞的细胞因子末次基因免疫后7d，常规处死实验小鼠并收集脾细胞，PBS洗涤后以2×106细胞浓度重悬，取100μL细胞悬液，加入PE标记的抗鼠CD19抗体，4℃共育30min，用PBS洗去游离的抗体重悬，经固定、穿膜和洗涤后，分别加入FITC标记的抗鼠IL-4抗体、IL-10抗体或IFN-γ抗体，4℃共育30min，PBS洗涤后用流式细胞仪检测B淋巴细胞的细胞因子表达情况。未与抗体作用的淋巴细胞作为空白对照。
1.7统计学处理数据以±s表示，采用SPSS12.0统计软件进行方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1CD25胞外段基因免疫小鼠血清抗体水平的变化用pcDNA3.1-CD25胞外段(记为pcDNA3.1-CD25)质粒基因免疫Balb/c小鼠，免疫后间隔10d常规眼球采血，检测血清中抗CD25胞外段抗体的水平。结果显示，与对照组相比，CD25胞外段基因免疫组小鼠血清抗体水平显著增加(P<0.05)，免疫30d后达到最高峰(P<0.05)，随着时间的延长，抗体水平逐渐降低，免疫后80d，仍可以检测到抗CD25胞外段的抗体(图1)。图1pcDNA3.1-CD25胞外段基因免疫小鼠血清中总Ig的水平Fig.1 The curve of serum antibody specific to CD25e in pcDNA3.1-CD25e immunized micePBS：PBS注射对照组;pcDNA3.1：pcDNA3.1空载体注射组;pcDNA3.1-CD25：pcDNA3.1-CD25e注射组;与对照组相比，*P<0.05。
2.2CD25胞外段基因免疫小鼠血清抗体的类型在此基础上，进一步检测基因免疫30d后小鼠血清抗体的类别。pcDNA3.1-CD25胞外段基因免疫小鼠血清中抗CD25胞外段的抗体以IgG为主(P<0.05)，并且主要是IgG1亚类(P<0.05，图2)。这提示pcDNA3.1-CD25胞外段基因主要诱发的是以Th3型为主的体液免疫应答。
2.3CD25胞外段基因免疫小鼠脾细胞中B细胞的比例与pcDNA3.1对照组相比，pcDNA3.1-CD25胞外段基因免疫小鼠脾细胞中B细胞的比例变化不显著，分别为(35.71±2.89)%和(31.83±3.68)%(P>0.05，图3)。图2pcDNA3.1-CD25胞外段基因免疫小鼠血清中IgG和IgA的水平(A)和IgG亚类的水平(B)Fig.2 The serum level of IgG and IgA (A) and subclass of IgG (B) in pcDNA3.1-CD25e immunized miceA：IgG与IgA浓度的比较，*P<0.05;B：IgG1与IgG2a浓度的比较，*P<0.05。图3CD25胞外段基因免疫小鼠脾细胞中B淋巴细胞的比例Fig.3 The percentage of CD19+ B cells in splenocytes from pcDNA3.1-CD25e immunized micePBS：PBS注射对照组;pcDNA3.1：pcDNA3.1空载体注射组;pcDNA3.1-CD25e：pcDNA3.1-CD25e注射组。
2.4CD25胞外段基因免疫小鼠脾细胞中B细胞的细胞因子分泌进一步检测了基因免疫后小鼠脾细胞中B细胞的细胞因子IL-4、IL-10和IFN-γ的表达情况。pcDNA3.1对照组中B细胞分泌细胞因子IL-4和IL-10的比例分别为(0.72±0.11)%和(3.67±0.45)%，而pcDNA3.1-CD25胞外段基因免疫小鼠脾细胞中B细胞高分泌IL-4和IL-10，分别为(2.44±0.13)%和(5.37±1.35)%(P<0.05，图4)。相反，pcDNA3.1-CD25胞外段基因免疫小鼠B细胞低表达IFN-γ，显著低于pcDNA3.1免疫对照组，分别为(1.96±0.21)%和(3.57±0.49)%(P<0.05)。这进一步提示，CD25胞外段基因免疫主要诱导的是以Th3型体液免疫应答为主。
3讨论
近年来，随着TCV国内外相关研究的不断深入，TCV已发展成为一种治疗自身免疫病、病毒感染、移植排斥等临床疾病的重要手段[13]。在TCV诱导的免疫调节作用机制探讨中，当前的研究主要围绕其诱发的细胞免疫反应而展开[14]。已有的研究发现，抗独特型T细胞和抗工作型T细胞这两个特殊亚群的T细胞在TCV诱发的免疫应答中发挥了重要作用。近年来，特别是工作型抗原如CD25、HSP60分子等的发现，使得人们对TCV诱导的免疫应答机制及机体免疫调节机制有了更深入的认识和理解[4，8]。
CD25分子作为自体抗原性分子，研究者们发现其可以有效诱发自体免疫应答。MOR等[15]发现CD25分子可以作为T细胞识别的靶分子，参与了TCV中T细胞与T细胞之间的调节过程。MIMRAN等[7]进一步用大鼠的CD25基因免疫同系大鼠，结果发现可以有效抑制后续类风湿关节炎的诱导，并认为其机制与CD25分子作为工作型抗原激活抗工作型T细胞有关。图4pcDNA3.1-CD25胞外段基因免疫小鼠脾细胞中B淋巴细胞的细胞因子分泌Fig.4 Production of IL-4， IL-10 and IFN-γ in B cells of splenocytes from pcDNA3.1-CD25e immunized micePBS：PBS注射对照组;pcDNA3.1：pcDNA3.1空载体注射组;pcDNA3.1-CD25：pcDNA3.1-CD25e注射组。
然而，CD25分子这一类工作型抗原诱发机体免疫应答的具体机制仍不明。我们新近的研究表明，利用小鼠CD25分子胞外段成分的基因免疫可以成功在同系小鼠体内诱发特异性抗体，并且能有效抑制后续自身免疫性肝损伤的诱导，减轻肝组织损伤[12]。这些研究提示我们，在T细胞疫苗诱发的免疫调节效应中，除抗工作型T细胞参与免疫调节以外，针对工作型抗原的体液免疫反应也在免疫抑制效应中发挥了重要作用。
在本研究中我们的结果进一步显示，CD25分子胞外段基因免疫诱发的特异性抗体以IgG为主，并主要为IgG1。这与我们前期的研究结果一致。在基因免疫30d后，抗体水平达峰值，以后逐渐降低。陈永良等[11]报道TCV诱导的体液免疫应答中，针对TCV的抗体主要以IgG为主。这与我们的结果是一致的。并且，我们还发现基因免疫小鼠脾细胞中B细胞的比例变化不明显，其分泌的细胞因子主要是以IL-4、IL-10为主，而分泌IFN-γ较少。提示CD25胞外段基因免疫主要诱导Th3型体液免疫应答为主。这与抗体亚类分析的结果是一致的。
总之，通过本研究，我们发现CD25胞外段基因免疫可以有效诱导B淋巴细胞高分泌IgG1为主的抗体和IL-4、IL-10，表现为以Th3型为主的体液免疫应答。这为后续深入研究工作型抗原CD25分子诱导体液免疫应答的机制及其参与TCV诱导免疫调节中的作用提供了前期实验结果。
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