人胚胎干细胞的研究进展

【关键词】 人胚胎干细胞;应用

　干细胞(Stemcell)是一类具有自我更新能力的多潜能细胞，即干细胞保持未定向分化状态和具有增殖能力，在合适的条件下或给予合适的信号，它可以分化成多种功能细胞或组织器官，又称其为“万用细胞”。干细胞来源于胚胎、胎儿组织和成年组织。根据发育阶段，干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。1998 年Thomson等〔1〕第一次从胚胎中分离培养了人体胚胎干细胞(human embryonic stem cell，hESC)，并随后发现它能分化为体内几乎所有的细胞后，由此掀起全球范围内的hESC研究热潮。本文对人胚胎干细胞的基本理论以及目前国内外人胚胎干细胞的实验研究和临床应用进行综述。

　　1 人胚胎干细胞的来源

　　胚胎干细胞来源于着床前的囊胚内细胞团(Inter cell mass，ICM)或早期胚胎的原始生殖细胞(Embryonic primordial germ cell， EG)，是一大类未分化的二倍体全能干细胞，具有无限增殖、自我更新和多向分化的潜能。1998年，Thomson等〔1〕首次报道在体外受精5 d的人囊胚中成功分离出人类胚胎干细胞(Human embryonic stem cell，hESC)，体外培养维持不分化状态均传代30代以上。同年，Shamblott〔2〕报道了从受精后5～9 w的人胚胎中含有原始生殖细胞的生殖嵴和肠系膜中成功分离培养出5 个多潜能干细胞系，其特征类似于胚胎干细胞，可连续传代且核型稳定。免疫组织化学分析表明其可分化为包括所有3 个胚层的组织。Thomson等和Shamblott分别用人胚胎干细胞和胚胎生殖细胞建立了胚胎干细胞系。Hwang等〔3〕应用体细胞核转移技术方法获得了胚胎干细胞，该方法将来源于供体体细胞的细胞核移植进入去除细胞核的卵母细胞，然后在体外将其培养至胚泡期，分离出胚胎干细胞，并可在体外将其定向诱导分化为各种特定的功能细胞，由这种方法获得的细胞或组织，遗传物质和供体一致，故移植后不会产生免疫排斥反应。

　　2 人胚胎干细胞的生物学特性

　　人胚胎干细胞有以下特性：(1)具有分化的多潜能性，在体外可诱导分化出属于三个胚层的分化细胞;(2)具有种系传递功能;(3)具有长期的未分化增殖能力，细胞不仅能分化成各种器官组织，而且能增殖生成新的保持同种性状的 ES 细胞;(4)易于进行基因改造操作;(5)保留了正常的二倍体的性质且核型正常;(6)胚胎干细胞端粒酶活性呈阳性，具有维持端粒长度，保持干细胞增殖能力的重要作用〔4〕。

　　人类ES细胞在形态和行为上与鼠ES细胞不同，其生长缓慢，往往形成扁平而非球形集落〔5〕，未分化人类ES细胞有典型形态，包括高核胞质比例和多巨核。人类ES细胞表达特征细胞表面标记，如SSEA3、SSEA4、TRA160和TRA181，但不表达SSEA1。人类ES细胞来源于非常早期的胚胎，有正常染色体并能延长增殖，它们表达高水平的端粒酶，没有复制衰老现象，提示这些未分化ES细胞系能无限增殖，有可能培养出无限数量的分化衍生物〔3〕。白血病抑制因子(LIF)能阻止鼠ES细胞分化，使其保持未分化状态，当去除LIF或饲养层细胞，许多类型的ES细胞将自动分化形成与种植后胚胎组织相似的拟胚体，这种球形结构包括3个胚层结构〔6〕。人类ES细胞可分化成各种细胞类型，包括内胚层、神经细胞和肌肉细胞等。当人类ES细胞注入免疫缺陷鼠体内，即形成有多种细胞类型分化的畸胎瘤，包括呼吸上皮和内脏上皮(内胚层);平滑肌、软骨、骨和连接组织(中胚层);神经组织、上皮和毛发(外胚层);及许多未分化细胞类型〔7〕。

　　3 人胚胎干细胞的建系和培养

　　3.1 胚胎干细胞的建系 在体外受精(IVF)治疗不孕症的过程中，B超介导下经阴道穿刺获取人卵母细胞，将卵母细胞和精子体外受精后培养至囊胚。然后可用免疫外科手术法、组织培养法、机械剥离法等，去除囊胚外层的透明带，分离出囊胚中的ICM。目前最常用的胚胎是冷冻胚胎，其次是新鲜胚胎、克隆胚胎。

　　将临床上人工终止妊娠的5～9周龄胎儿，用加有青霉素、链霉素的PBS反复洗涤，剪开胎膜，小心分离出胚胎，在解剖镜下用眼科剪剪取胚胎生殖嵴及周围组织，剪碎，用消化液消化，离心去上清，加入培养液，置于小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养。一段时间的培养后，hESC从内细胞团中爬出，经过反复传代，建成hES细胞系。

　　3.2 胚胎干细胞的培养

　　3.2.1 常规培养液 常用的基础培养基有改良伊格尔培养基(MEM)α、达氏修正依氏培养基(DMEM)、组织培养基(TCM)199、F12 等合成培养基，以 DMEM应用最为普遍。它的主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和一些其他辅助物质。

　　3.2.2 无血清培养基 血清中含有许多未知的成分和一些分化诱导因子，不利于 ESC 未分化状态的维持。为此人们尝试使用无血清培养液〔8〕、化学合成培养液〔9〕进行 ESC的培养，加入刺激细胞生长的激素、细胞因子等，实验表明ESC增殖旺盛，且能保持未分化状态，并认为无血清培养基优于血清培养基〔10〕。但也有学者认为含血清培养液更利于胚胎干细胞向中胚层细胞分化，是因为血清中富含中胚层诱导因子，如骨形态形成蛋白(bone morphogenic proteins，BMP)等〔11〕。

　　3.2.3 饲养层(feeder layer) 饲养层〔12〕培养体系的建立是ESC体外培养建系中最常用的一种技术方法。饲养层细胞经射线照射或丝裂霉素 C 处理后，虽然失去分裂能力，但仍能保持生存，并有同化培养液的能力，为胚胎发育提供一些必需因子，如成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子等促有丝分裂因子，白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)等细胞分化抑制因子，促进其增殖，抑制其分化。目前常用的饲养层有STO、小鼠胚胎成纤维细胞(primary mouse embryonic fibroblast，PMEF)、SNL (G418R 基因和 LIF基因转染的 STO)、HBC5637等。其中 MEF 以其易于取材、抑分化效果好等特点而被广泛应用〔13〕。但Stacey等认为饲养层技术存在多种细胞因子可使ESC的研究及未来的临床应用复杂化〔14〕。使用人源性体细胞作饲养层建立一株无动物源性蛋白污染的细胞系，可能将为今后临床治疗性的应用提供安全的来源。Richards〔15〕等报道流产胎儿皮肤、肌肉细胞、成人输卵管上皮细胞体外培养后均能够支持hES细胞的体外扩增，并且他们使用人血清代替SR或胎牛血清。CHENG〔16〕等报道用人的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells ，MSC)作为饲养层细胞支持hES细胞的生长，经过13代的传代，细胞仍保持hES细胞未分化状态的分子生物学的特征。安世民〔17〕等通过人胚胎干细胞经体内分化获取间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)为人胚胎干细胞提供一种新的滋养层，研究表明来源于hESCs本身的MSCs可以被用来作为支持胚胎干细胞生长并维持其未分化状态的滋养层细胞。

　　3.2.4 无饲养层培养方法 目前已报道的有三种无饲养层培养方法。(1)Xu 等提出以MEF的条件培养液作为添加成分，辅助以Matrix〔18〕。(2)在培养液中加入TGFβ、LIF及bFGF，辅助以Fibronectin 〔19〕。Carpenter 等〔20〕建立了长期无饲养层培养hESC 的培养体系。该系统以85 % Knockout DMEM 为基础培养基，用15% KnockoutSR 和bFGF 替代血清，在此基础上添加保持未分化和促进hESC 增殖的细胞因子：TGFβ1、LIF 和Fibronectin基质。其中Fibronectin 可以增加细胞与培养皿的黏附，并可通过其受体Integrin 激活一系列信号途径调节细胞的活动，包括细胞的增殖、凋亡和分化等。但与MEF 饲养层上生长的hESC 相比，其增殖和分化潜能均略降低。且SR 含Albumax，是一种富含脂类的牛血清白蛋白，故有待进一步优化。(3)通过使用特异性化学药物激活Wnt信号途径来维持ES细胞在无饲养层条件下的生长〔21〕。近来，Bigdeli等〔22〕报道利用人成纤维细胞来源的培养基，无需培养基质包被培养皿，成功建系，该方法具有大规模生产的能力，可很好的应用于细胞治疗及毒性试验等不同的情况中。 然而这些培养方法是否能够维持hESC长期体外生长而不改变其特性，长期培养过程中是否会更易于产生异常核型的ES细胞，尚有待于观察。

　　4 人胚胎干细胞的实验研究及临床应用

　　4.1 人胚胎干细胞的实验研究 人ES细胞具有多向分化潜能，能分化为属于内胚层、中胚层和外胚层范畴的多种类型细胞:包括神经细胞、肝细胞、造血母细胞、分泌胰岛素细胞、心肌细胞、内皮细胞等。人胚胎干细胞定向诱导是指在体外把人胚胎干细胞定向诱导成分化成熟功能细胞，而横向分化则是把一种组织的成体干细胞诱导分化成另一种组织的“干细胞”或功能细胞，不论定向诱导，还是横向分化，它们的共同基础都是干细胞基因表达的调控。定向诱导分化根据hESC在离体条件下可分化出不同胚层的分化细胞这一特点，将hESC 与不同类型的细胞共培养或加入相应的生长因子诱导干细胞定向单一类型的细胞分化。目前，hESC体外诱导分化的模式主要有诱导分化、自发分化和基因调控分化等。大量的研究〔23〕表明转化生长因子(TGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、Wnt家族蛋白 (Wnt families)、成纤维细胞生长因子(FGF)以及全反式维甲酸(RA)、二甲基亚砜(DMSO)和垂体后叶素、维生素C、5氮胞苷等可以促进ESC分化为心肌细胞。Laura等〔24〕将人胚胎干细胞(hESC)体外诱导分化的心肌细胞，培养观察了达3个月，并通过膜片钳等技术来评估其功能成熟情况，以RTPCR来评估编码离子通道的亚基的表达;发现随着体外培养时间的延长，ESC分化的心肌细胞愈接近成熟心肌细胞表型。常静等〔25〕发现与胎儿心肌细胞的共同培养，能诱导人ESCs发生向心肌方向的分化，人ESCs有望成为心肌干细胞移植的细胞材料。Passier等〔26〕采用无血清培养基诱导胚胎干细胞，发现心肌自发搏动的数量较含血清培养增加了24倍，如果在培养体系中加入维生素C，分化效率还可以再提高40%。Maxim等〔27〕发现HESC与骨髓基质细胞或OP9细胞共培养可诱导hESC向造血干细胞分化。Rambhatla等〔28〕观察到，hESC 培养过程中在二甲基亚砜和丁酸钠依次诱导下形成肝细胞。裴海云〔29〕等将人胚胎干细胞在细菌培养皿中悬浮培养7 d，形成囊性拟胚体，接种至包被有Ⅰ型胶原的组织培养皿，以含有地塞米松、胰岛素的条件培养液进行诱导，条件诱导液培养14 d，结果证实人胚胎干细胞经上述方法培养可向肝细胞分化。李彬等〔30〕采用单层贴壁分化的方法在无血清条件下诱导同源饲养层培养的人胚胎干细胞定向分化，得到了高比例的神经前体细胞。这些神经前体细胞具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力。人胚胎干细胞来源的神经前体细胞能够模拟体内神经发育的模式，为在体外研究人的神经发育和再生医学奠定了基础。Reubinoff等〔31〕报道，hESC培养过程中加入bFGF、维甲酸和神经生长因子后可形成大量的神经管样结构，并能进一步分化成神经元、星形细胞和少突胶质细胞。Vogel〔32〕将人ES细胞培养至拟胚体(EBs)后，用神经细胞培养基(常规培养神经细胞的培养基)培养，分离出部分分化的EBs在含碱性成纤维生长因子(bFGF)的培养基中培养，最终获得96%表达神经元标志的细胞。Kwon等〔33〕在实验中将TATPDX1融合蛋白转入HESC，从而激活下游靶基因的表达，促进干细胞分泌胰岛素，比较明确的阐明了干细胞向胰岛细胞分化的机制。Kroon〔34〕等将人胚胎干细胞源性胰腺内皮层移植进入大鼠后有效的产生葡萄糖应答内皮细胞，表明人胚胎干细胞有能力产生葡萄糖应答和胰岛素分泌细胞。Tremoleda〔35〕等比较人胚胎干细胞与成体干细胞的体内骨分化能力，结果经过成骨因素予处理的hESC均产生成骨，未经过成骨因素予处理的hESC产生骨与软骨;而未经过成骨因素予处理的hMSC则不形成骨、软骨与脂肪组织，经过成骨因素予处理的hMSC产生骨与脂肪组织。Masakatsu等〔36〕确定了人ES细胞分化为血管细胞成分的过程，从而为血管再生医学奠定了基础。Christian等〔37〕则通过研究得出结论，维甲酸和骨形态发生蛋白两种信号协同，可大大提高人的ES细胞向上皮细胞的直接分化的效率。石伦刚等〔38〕成功诱导人胚胎干细胞向类间充质干细胞分化。分化获得的细胞增殖能力强，表达间充质干细胞的特异性标志，并具有多向分化潜能。到目前为止，人类胚胎干细胞被成功诱导分化为造血干细胞、神经干细胞、心肌细胞、肝细胞、胰岛细胞、成骨细胞、内皮细胞及滋养细胞等多种细胞，为hESC分化细胞的移植研究与应用奠定了实验基础。同时，国外学者将人胚胎干细胞源性神经祖细胞移植于远端中脑动脉阻塞的大鼠，在移植后的2个月，移植细胞表达神经元标志物且部分改善大鼠的感觉运动功能〔39〕，展现了人胚胎干细胞在移植与再生医学的良好前景。

　　4.2 人胚胎干细胞的临床应用 hES可诱导分化为多种细胞，如神经细胞、心肌细胞和肝脏细胞等，通过移植取代体内死亡或无功能的细胞提供长期治疗，可为帕金森病、心脏病、青少年糖尿病和白血病和肝脏疾病等多种临床疾病无限量提供细胞移植供体，从而使此类疾病在治疗上发生革命性变化〔40～44〕。Roberto研究表明，随着胚胎干细胞研究的发展，将其诱导分化为成熟的多巴胺能神经元及用来激活自身体内的修复机制，治疗帕金森病是可能的〔45〕。通过hESC建立体外分化模型，建立各种基因改变的hESC，可发现某些基因或细胞因子在胚胎发育早期对不同类型细胞或组织分化的作用，从而研究人类发育早期事件。遗传工程技术的应用，在体外定向改造ESC细胞后，可对胚胎干细胞进行基因改造，将特殊改变的基因转导至胚胎干细胞中，体外选择后将胚胎干细胞导入机体，使胚胎干细胞中的遗传信息传达给子代〔46～48〕，这可能有助于某些遗传性疾病的治疗。还可将胚胎干细胞中某个基因敲除或将外来的某个基因导入，用于研究特定基因对胚胎发育、药物代谢和肿瘤形成的影响，模拟细胞、组织在体内对被试药物及毒素的反应情况，为药物筛选和潜在的毒素筛选提供更安全、廉价的模型。尽管采用干细胞移植治疗疾病的研究取得了较大进展，但离临床应用还存在相当的距离。

　　5 问题与展望

　　胚胎干细胞在揭示生命，药物筛选、新药开发，移植治疗及研究胚胎发育和疾病发生和遗传性疾病具有极为广阔的前景〔49〕，但目前尚有许多的问题需要我们去解决，首先，须进一步的改善人胚胎干细胞的分离、培养、建系的工作〔50〕，明确细胞分化的触发与调控机制，掌握体外控制干细胞定向分化技术，控制ES细胞将特定细胞分化的基因和环境信号，将ES细胞定向诱导生成一种特定的细胞及一个复杂的组织或器官，建立更多的hESC系并对其特性进行研究，解决现有的hES细胞仍达不到临床应用的标准、可能存在异源蛋白污染及长期体外培养的hES细胞出现分化比例偏高和基因突变，甚至染色体也会出现非整倍体改变的危险。其次，细胞或组织移植后，可能存在ESC致癌或形成组织瘤问题;胚胎干细胞诱导分化的细胞和组织若用于患者的替代性治疗，存在免疫排斥反应问题，如何克服移植排斥反应是hESC成功应用于临床的前提;体细胞核转移技术所需时间长，对实验室设备要求高以及分化细胞的增殖。因此，只有进一步深入研究，才能为人胚胎干细胞在治疗性药物筛选、临床细胞治疗和组织工程等方面的应用奠定良好的基础。

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