老年缺血性脑梗死患者胱硫醚β合酶基因C572T突变频率的研究

　　　　　　 作者：李金平 顾国龙 李丽帆

【关键词】 缺血性脑梗死;胱硫醚β合酶;同型半胱氨酸;基因频率

　近年来的研究认为，高同型半胱氨酸血症(HHcy)是动脉粥样硬化(AS)性血管疾病新的独立危险因素〔1，2〕。胱硫醚β合酶(Cystathionine βsynthase，CBS)为同型半胱氨酸(Hcy)代谢途径的关键酶，其编码基因CBS基因突变可引起酶活性改变，从而影响Hcy代谢。CBS C572T是CBS基因的高频率突变位点，在欧美一些国家的人群中比较常见，且突变可导致HHcy〔3～5〕。本文前期研究曾对64例冠心病患者和32名正常对照者进行CBS C572T 突变频率分析，发现两组间差异无显著性〔6〕。为了进一步了解该位点与老年缺血性脑梗死的关系，本研究对老年缺血性脑梗死患者及正常人进行CBS C572T基因突变频率检测，从基因水平初步探讨该突变位点在老年缺血性脑梗死发病中的作用。

　　1 资料与方法

　　1.1 研究对象 选择2006年7月至2008年7月我院神经内科收治的75例缺血性脑梗死患者(病例组)，符合1996 年中华医学会第四次全国脑血管学术会议制定的脑血管病诊断标准，均经头CT或MRI证实，其中男41例，女34例，年龄65～79〔平均(72.6±4.3)〕岁，均为广西汉族人;同时随机选取同期来我院健康体检正常的汉族人50例作为对照组，男33例，女27例，年龄65～75〔平均(70.3±6.2)〕岁。两组均排除伴有恶性肿瘤、血液病、胶原病、严重心、肝、肺、肾脏系统疾病者;出血性脑梗死者;短暂性脑缺血发作者。

　　1.2 研究方法

　　1.2.1 标本的采集和处理 受试者清晨空腹抽外周静脉血2 ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，3 000 r/min离心5 min，分离白细胞，采用酚氯仿法提取基因组DNA，8 g/L琼脂糖凝胶电泳检测基因组完整性，紫外分光光度计测DNA含量和纯度。

　　1.2.2 CBS C572T基因型检测 等位基因特异性扩增法检测CBS 基因型。PCR反应试剂购自TaKaRa公司，PCR仪、凝胶成像系统及Quantity One软件为Biorad公司产品，琼脂糖为Biowest Agarose，溴化乙锭购于华美生工。PCR引物反应体系及程序:野生正向引物(DNA位置6 696～6 714):5′GGGCTGAGATTGTGAGGAC3′，突变正向引物:5′GGGCTGAGATTGTGAGGAT3′，反向引物(DNA位置7 030～7 045)：5′ACACTCCCAGGCAGCC3′，由上海生工合成。产物317 bp。PCR反应体系50 μl，包括DNA模板0.2 μg，10 μmol/L dNTPs 1 μl，10 μmol/L引物各2 μl，10×PCR缓冲液5 μl，Taq聚合酶1.25 U，25 mmol/L MgCl2 3 μl。PCR反应扩增程序:95℃预变性2 min，然后95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共35个循环，最后延伸72℃ 7 min。将PCR产物于15 g/L琼脂糖凝胶，80 V电压下电泳35 min，溴化乙锭染色，以DL2000为DNA Marker，凝胶成像系统观察带型并照相。

　　1.3 统计学方法 用SPSS11.5软件处理数据，计数资料采用行×列表χ2检验，并计算比值比(Odds Ratio，OR)及95%的可信区间(CI)，估计基因突变频率对疾病发生的相关危险度。

　　2 结 果

　　2.1 基因型的确定 扩增产物大小为317 bp，产生三种基因型:野生型C/C、杂合型C/T和纯合型T/T。见图1。图1 C572T扩增产物琼脂糖凝胶电泳图

　　2.2 基因突变频率分析 病例组C/C、C/T、T/T型及T等位基因频率与对照组比较，差异无统计学意义(P&>0.05)。C/T型病例组OR为0.78(95%CI为0.29～2.11)，T/T型病例组OR为1.71(95%CI为0.32～9.20)，提示C572T与老年缺血性脑梗死无明显相关性。见表1。表1 两组C572T基因突变频率及等位基因频率分布

　　3 讨 论

　　HHcy为AS性血管疾病的一个独立危险因素近年来已得到广泛的认可，HHcy通过损伤血管内皮细胞、刺激血管平滑肌细胞增生、促进血栓形成以及活化炎症因子等途径参与AS形成〔3〕。缺血性脑梗死的主要病理基础是AS，而老年性AS的形成极易引起脑、心、肾等诸方面并发症，增加脑梗死危险性。

　　CBS是Hcy代谢关键酶之一。在辅酶吡哆醛磷酸参与下，CBS催化β置换反应，使Hcy与丝氨酸缩合生成胱硫醚，后者在胱硫醚γ酶作用下进一步转变成半胱氨酸和α丁酮酸。体内约53%的Hcy被CBS和胱硫醚酶不可逆转化为半胱氨酸，CBS在维持Hcy正常代谢方面起重要作用。人CBS基因定位于染色体21q23，全长25～30 kbp，包含23个外显子，编码CBS多肽551个氨基酸残基。在目前已知的CBS基因140多个突变点中，大多数为错义突变和缺失突变，不同突变点对CBS活性的影响不尽相同，同一突变点可能存在种族或地区差异。C572T位点位于编码区第5外显子，cDNA的第572位(基因组第6 714位)C被T替代，使第191位密码原编码的苏氨酸变为蛋氨酸(pT191M)，导致酶活性严重下降，引起Hcy代谢障碍、进而形成HHcy。哥伦比亚HHcy患者C572TT等位基因突变频率高达75%，在西班牙和葡萄牙约为50%，而在南美委内瑞拉、阿根廷和巴西分别为25%、20%和14%〔3～5〕。以往的研究显示，C572T中T等位基因频率在广西冠心病患者为48.4%，在正常人为46.6%，二者差异无统计学意义〔6〕。目前尚未见C572T与老年缺血性脑梗死的相关性研究报道。本研究中，老年缺血性脑梗死组(病例组)基因型T/T、C/T型及T等位基因频率分别为6.7%、82.6%和48.0%，而对照组分别为4.0%、86.0%和47.0%，两组基因型及等位基因频率比较，差异均无统计学意义，提示C572T与广西汉族老年缺血性脑梗死病无明显相关性;C/T、T/T型OR小于或略大于1.0，提示C572T可能不足于构成广西汉族老年缺血性脑梗死发病的独立遗传危险因素，该地区汉族老年缺血性脑梗死的发病可能更多地受到高血压、高血脂以及与Hcy代谢相关的其他酶基因突变等综合因素影响。老年缺血性脑梗死作为多因素、多基因参与形成的疾病，单纯从CBS某个或某几个突变位点来确定其对该病的作用，其意义可能十分有限，况且研究本身受样本量和基因位点代表性的限制。因而，要全面阐述CBS基因突变与老年缺血性脑梗死的关系，还需在此基础上进一步增加样本及多基因、多位点、多因素的综合研究。

参考文献

　1 邵 燕，章成国，胡学强.血浆同型半胱氨酸及其酶基因多态性与老年脑梗死的关系〔J〕.临床神经病学杂志，2006;19(1):224.

　　2 朱文丽，宋晓明，李孟忆，等.CBS基因变异与血清同型半胱氨酸水平及先天性心脏病的关系研究〔J〕.卫生研究，2008;37(4)：46367.

　　3 Bermudez M，Frank N，Bernal J，et al.High prevalence of CBS T191M mutation in homocystinuric patients from Colombia〔J〕.Hum Mutat，2006;27(3):2969.

　　4 Porto MP，Galdieri LC，Pereira VG，et al.Molecular analysis of homocystinuria in Brazilian patients〔J〕.Clin Chim Acta，2005;362(12):718.

　　5 Urreizti R，Asteggiano C，Cozar M，et al.Functional assays testing pathogenicity of 14 cystathioninebeta synthase mutations〔J〕.Hum Mutat，2006;27(2)：2117.

　　6 李丽帆，李金平，顾国龙.冠心病患者胱硫醚β合酶基因C572T突变频率检测及临床意义〔J〕.山东医药，2008;48(2):12.