作者：张春江 贺德刚 段炜 陶林 杨晓萍
【摘要】 目的 观察促肝细胞生长素（Hepatocyte Growth-promoting Factor，pHGF）对大鼠微小病变肾病(MCD)中整合素连接激酶（Intergrin Linked Kinase，ILK）表达的影响。方法 雄性SD大鼠72只，随机分为对照组、模型组、pHGF干预组各24只，一次性尾静脉注射阿霉素建立大鼠微小病变肾病模型，pHGF干预模型组于造模2周后腹腔注射pHGF30mg／kg，电镜观察大鼠肾小球足细胞形态学变化，免疫荧光观察各组大鼠在4周内肾小球足细胞中ILK表达情况。结果 ①电镜结果显示：模型组大鼠7天和14天足细胞广泛足突融合；pHGF干预模型组足细胞的足突变形、融合较模型组有所减轻；②与对照组相比，模型组大鼠肾小球ILK蛋白的表达7天减少，14天明显增加，差异有统计学意义（p&<0.05）；与模型组相比，pHGF干预模型组大鼠肾小球ILK蛋白的表达第21天出现减少，第28天达到最低值，差异有统计学意义（p&<0.05）；结论 ①ILK表达增加及分布异常，与足细胞病变密切相关，可能是判断肾小球足细胞损伤及导致蛋白尿原因的一个早期重要指标。②pHGF能抑制微小病变肾病大鼠肾小球ILK蛋白的表达，对MCD在肾脏结构及功能上既有保护作用又有治疗作用。
【关键词】阿霉素肾病 整合素连接激酶 促肝细胞生长素
肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)是具有广泛生物学活性的细胞因子，能刺激多种上皮和内皮细胞进行有丝分裂、运动，在肾小管形态发生、肾组织的损伤修复和再生中也起着非常重要的营养作用。促肝细胞生长素(hepatocyte growth-promoting factor，pHGF)是从乳猪提取的相对分子质量10700左右的活性多肽，具有与HCF有相似的效用[1]。整合素连接激酶（integrin- linked kinase，ILK）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在调节细胞周期、基质积聚、肿瘤发生等中都起重要作用[2，3]。研究发现：ILK在微小病变肾病(minimal change disease，MCD)大鼠中表达的改变，可能直接或间接地影响了足细胞的功能状态[3，4]。然而，ILK表达的调控机制尚不清楚。本研究予促肝细胞生长素干预MCD大鼠肾小球足细胞，探讨pHGF对MCD大鼠肾小球足细胞ILK表达及肾脏组织病理学的影响。
1 材料和方法
1.1 主要试剂
阿霉素（深圳万乐药业有限公司）；兔抗ILK抗体（美国Santa Cruz）；罗丹明标记羊抗兔抗体（北京博奥森生物技术有限公司）。促肝细胞生长素（南京南大制药有限公司，批号: 20070206）。
1.2 动物模型的建立
清洁级雄性SD大鼠72只，体重180～220g，由新疆实验动物研究中心提供。将大鼠随机分为对照组、模型组、pHGF干预模型组各24只，后2组采用尾静脉注射阿霉素（浓度2mg/ml，7.5mg/kg剂量），建立MCD[6]，对照组尾静脉注射等体积生理盐水，观察28天，pHGF干预模型组于造模2周后腹腔注射pHGF，30mg/kg.d，共14天。
1.3 标本的收集及检测
分别于建模后第7、14、21、28天宰杀大鼠，每组各6只。大鼠处死前1天代谢笼收集24小时尿液，采用磺基水杨酸法测24小时尿蛋白定量；处死前动物麻醉通过内眦静脉采血，取血清测血浆白蛋白；留取大鼠肾脏进行病理检测。
1.4 肾脏病理检查
①大体标本观察；②光镜观察：肾组织经10%中性缓冲福尔马林固定，石蜡包埋切片，HE、PAS、Masson三色染色观察。③电镜观察：取约1mm3的肾皮质组织块，经2.5%戊二醛固定、1%锇酸后固定、脱水、环氧树脂618包埋，超薄切片后醋酸铀-柠檬酸铅染色，J EM1010透射电镜下观察。
1.5 肾小球ILK免疫荧光染色及定量分析
肾组织置液氮冰冻包埋，以3μm厚度在-20℃恒冷冰冻切片机连续切片，冻存于-20℃，37℃干燥，在4%多聚甲醛溶液中固定30min，PBS洗涤，10%正常山羊血清封闭1h，用一抗（抗ILK抗体）孵育（4℃过夜），PBS洗涤，再用罗丹明标记的抗-兔IgG二抗（37℃1h）孵育，PBS洗涤，DAPI封片。用PBS代替一抗作阴性对照。所有切片均在德国ZEISS公司ISM510型激光共聚焦扫描显微镜下进行单盲读片，每个标本均采集3个肾小球进行分析。用Zeiss LSM多功能真彩色图像分析系统测定肾小球中ILK的平均吸光度值作为各观察标本的表达量。若阳性信号分布均匀、连续，视为表达完整，ILK蛋白存在；若信号分布不均匀或节段消失，则视为表达部分缺失，ILK蛋白部分脱落。
1.6 统计学方法
观察指标以均数±标准差表示。运用SPSS13.0软件，对实验数据进行统计学处理。多组比较时，若方差齐则采用单因素方差分析；若方差不齐则采用秩和检验。相关分析采用Spearman相关分析方法。P&<0.05表示有统计学意义。
2 结果
2.1 各组肾小球的组织结构与超微结构
肾小球的超微结构如图1所示：光镜及电镜观察对照组肾小球的结构正常，足细胞无脱落，足突形态正常；模型组于第14天可见系膜细胞稍增多，部分基底膜裸露，足细胞的少量脱落，足突的部分融合；pHGF干预模型组第28天可见足细胞脱落减少，足突形态正常。
2.2 各组肾小球ILK表达定位分布与表达荧光的形态计量
荧光显微镜下观察ILK蛋白在肾小球的定位分布规律（如图2）：对照组ILK沿肾小球基底膜连续均匀分布，呈线型荧光；模型组可见ILK表达呈点状或短线状，基底膜荧光有节段性缺失；干预组21天时可见肾小球中ILK沿肾小球基底膜连续均匀分布有所恢复，随着时间的进展，ILK蛋白的表达量减少，但它的荧光表达沿肾小球基底膜又恢复呈线型荧光。ILK表达荧光的形态计量数据统计分析结果显示：模型组肾小球中的ILK表达量在第7天时与对照组相比，差异无统计学意义，但随着时间的推移，模型组肾小球中的ILK表达量在第14天出现增加，第21天达到最大值，与对照组相比，差异有统计学意义（p&<0.05）；pHGF干预模型组肾小球中的ILK表达量在第21天出现减少，第28天达到最低值，与对照组、模型组相比，差异有统计学意义（p&<0.05），结果见表1。
图2 各组大鼠21天肾小球中ILK免疫荧光表达结果(×400)
注：#模型组与★对照组相比较，p&< 0.05 ▲干预组与★对照组相比较，p&>0.05
#模型组与▲干预组相比较，p&< 0.05
2.3 各组尿蛋白及血清白蛋白的变化
各组大鼠24小时尿蛋白数据统计分析结果显示：模型组24小时尿蛋白从第7天开始增加，于第21天达到高峰，均高于对照组，差异有统计学意义（p&<0.01）而HGF干预组大鼠的24小时尿蛋白在21天及28天均明显高于对照组，差异有统计学意义（p&<0.01）。但HGF干预组大鼠的24小时尿蛋白在21天及28天均明显低于模型组，差异有统计学意义（p&<0.05），见表1。
注：#模型组与★对照组相比较，p&<0.01 ▲干预组与★对照组相比较，p&< 0.01
#模型组与▲干预组相比较，p&< 0.05
各组大鼠血清白蛋白水平数据统计分析结果显示：与对照组比，模型组血清白蛋白从第7天开始下降，于第21天降至最低点，差异有统计学意义(p&<0.01)；HGF干预模型组血清白蛋白在21天及28天均明显高于模型组，差异有统计学意义(p&<0.05)，结果见表3。
#模型组与▲干预组相比较，p&< 0.05 ▲▲干预组28d与★对照组相比较，p&> 0.05
2.4 ILK表达量与24小时尿蛋白的相关分析
相关分析结果显示，模型组大鼠在不同时间点肾小球中ILK的表达量与模型组大鼠的24小时尿蛋白量之间呈正相关（r = 0.743，P &< 0.01）。
3 讨论
新近研究显示:ILK主要以外周方式存在于肾小球，在肾小球足细胞呈强染色，对维持肾小球基底膜的完整性、保持肾小球的滤过功能和防止蛋白质的漏出有重要意义[5-7]。当肾小球足细胞中ILK活性增加时会导致足细胞中β-连环蛋白向细胞内的定位，促进足细胞与基底膜的分离、增殖，抑制裂孔膜表面的P-钙粘蛋白和CD2AP分子的表达[8]，从而导致肾小球滤过膜的损伤和蛋白尿的形成。有实验发现PINCH-1-ILK-α-parvin信号转导途径对于肾小球足细胞与基底膜的粘着、结构的改变和生存起着重要的作用[9]。在正常足细胞中该复合物对于足细胞与基底膜的粘连，维持足细胞的寿命起着重要的作用；但ILK锚蛋白重复序列的过表达会抑制PINCH与ILK的结合，导致足细胞和层粘连蛋白的粘着降低，促进细胞的凋亡，使裂孔膜的完整性受到破坏，滤过屏障受到破坏，导致蛋白尿的发生。ILK还能促进基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的分泌，MMP-2会导致基底膜的降解，使基底膜的完整性受到破坏，导致蛋白尿的发生。
本研究结果显示：阿霉素肾病模型组大鼠建立的早期(7天)出现典型的蛋白尿和低蛋白血症，肾小球内ILK的表达下降；随着造模时间的推移，大鼠尿蛋白进一步增加，大鼠肾小球中出现ILK表达量的增加，并于第21天时达高峰，相关分析显示：模型组大鼠不同时间点的肾小球ILK表达量与24 h尿蛋白量成正相关，提示肾小球中ILK表达与模型大鼠蛋白尿的发生发展密切相关。分析其原因，在模型初期，ILK的表达水平下降，可能为足细胞遭受损伤所致；随着时间延长，足细胞通过有限的增生能力来代偿缺失的细胞功能，LIK的表达开始上升；当损伤进一步加重时，足细胞失去代偿能力，导致肾小球滤过膜的完整性遭到破坏，产生大量蛋白尿，此时免疫荧光结果也显示ILK的分布从沿着基底膜线样分布逐渐转变为不连续性颗粒样或节段性斑片状分布。据此推测，在阿霉素肾病模型中，足细胞ILK的表达发生了一定程度的变化，打乱了它与其他裂隙孔膜蛋白分子以及足细胞内细胞骨架之间的正常连接，继而导致了足突形态的改变以及蛋白尿的发生。
肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)是一种多效性生长因子，也是肾脏的调理素。当肾脏发生损伤时它具有潜在的促进肾脏组织重建的功能[10]。HGF可能通过稳定Smad转录辅阻遏物SnoN，抑制它们对转化生长因子(TGF-β1)目的基因转录激活的能力，从而减轻组织纤维化和功能障碍[10，11]。有已有研究证实pHGF可促进肾组织中HGF的表达[12]，具有HGF相似的功能。在我们的实验中，pHGF注射2周后肾组织中足细胞脱落减少，足突融合减轻；24小时尿蛋白均明显低于对照组和模型组，血清白蛋白均明显高于对照组、模型组；免疫荧光显示：ILK在注射pHGF后逐渐恢复了沿肾小球基底膜的连续性线性分布规律，ILK表达量在注射pHGF后第1周出现减少，第2周达到最低值，明显低于对照组、模型组（P&<0.01），相关分析显示：pHGF干预后ILK表达的变化与肾病模型大鼠24h尿蛋白定量的变化呈负相关。探讨其原因：可能是因为pHGF抑制转化生长因子β1(TGF-β1)的表达，而ILK作为TGF-β1的目的基因，其表达也受到明显的抑制，故在此实验中当给予pHGF治疗后第21天我们就检测到干预组肾小球中ILK表达量的明显减少，并在免疫荧光显微镜下观察到ILK沿肾小球基底膜的线性均匀分布的逐渐恢复，电镜观察到足细胞的足突形态有所恢复，蛋白尿的减少，血清白蛋白水平升高，说明我们用HGF的干预治疗有效。
综上所述，本研究结果表明pHGF能够抑制微小病变肾病大鼠肾小球足细胞ILK蛋白质的表达，提示pHGF对肾脏组织局部ILK的高表达以及肾脏固有细胞ILK的高表达具有直接调控作用，减少足细胞损伤脱落，进而减轻蛋白尿，其中抑制ILK的表达为其肾保护作用的基础。但是pHGF的组织细胞分布、分泌方式、作用机制、与其他细胞因子、蛋白多肽的区别与联系，以及刺激肾小球足细胞ILK蛋白质表达水平降低的细胞内信号传导途径有待进一步的研究。
参 考 文 献
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