蛇床子素对Aβ2535诱导的星形胶质细胞NFκB活化机制的影响

　　　　 作者：程淑意，陈云波，王奇，梁伟雄，温泽淮

【摘要】 【目的】 探讨蛇床子素(Osthole，Ost)拮抗β淀粉样蛋白2535(Aβ2535)毒性损伤、保护神经细胞的作用及其与核因子κB (NFκB)活化机制的关系。 【方法】 以原代培养的大鼠星形胶质细胞(astrocytes， AS)为靶标建立阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)细胞模型。采用CCK8(cell counting kit8)法检测细胞活力，进行Aβ2535造模浓度、时间以及Ost预处理最适宜浓度的选择。经Aβ2535和Ost干预后，采用激光共聚焦显微镜检测分析异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(FITC/PI)双重标记的NFκB与其抑制蛋白(IκBα)在细胞内的激活程度， 结合形态学观察分析Ost对星形胶质细胞的保护作用。 【结果】 Ost可拮抗Aβ2535的神经毒性作用，尤其以低浓度(001～1 μmol/L)为佳，随着浓度的升高，对细胞的保护作用呈减弱趋势。40 μmol/L的Aβ2535作用于AS 24 h可过度活化NFκB的表达(P &<001)，激活IκBα发生磷酸化及降解(P&<001)。低浓度的Ost可显著抑制NFκB的过度活化(P&<001)，上调细胞核内IκBα的表达(P&<001)。【结论】 Ost抑制Aβ2535的神经毒性作用，延缓AD发生发展的作用机理可能与NFκB活化机制有关。

【关键词】 蛇床子素/药理学;阿尔茨海默病/中药疗法;星形胶质细胞/病理学;细胞培养

蛇床子是伞形科一年生草本植物蛇床[Cnidium monnieri(L)Cusson]的成熟果实，蛇床子素(osthole，Ost)是从蛇床子中提取的一种天然香豆素。研究表明[15]，Ost对机体多个系统均具有较好的作用，尤其在中枢神经系统方面，如改善学习记忆、抗衰老、镇静抗炎等。Ost防治疾病的作用机制以及核因子κB(nuclear factor kappa B，NFκB)作为一种重要的核转录因子在此机制中所起的作用尚属未知。本研究通过观察Ost保护星形胶质细胞(astrocytes，AS)的作用及其与NFκB信号传导通路之间的联系，初步探讨Ost在细胞学领域防治阿尔茨海默病(Alzheimers disease， AD)的作用机制。现将结果报道如下。

　　1材料与方法

　　11实验动物新生24 h内的SPF级SD大鼠由广州中医药大学实验动物中心提供[合格证号：SCXK(粤)20030001]。

　　12主要试剂和仪器蛇床子素(购自中国药品生物制品检定所，批号：110822200305)，β淀粉样蛋白2535 (Aβ2535) 冻干粉(购自首都医科大学宣武医院神经生化室)，CCK8(cell counting Kit8)试剂盒(购自株式会社同仁化学研究所)，高级DMEM(高糖)培养基(Gibco公司)，特级胎牛血清(Hyclone公司)，胰蛋白酶粉末(Amresco公司)，NFκB p65兔抗鼠抗体(Calbiochem公司)，NFκB抑制蛋白(IκBα)兔抗鼠抗体(中山金桥公司)，羊抗兔异硫氰酸荧光素(FITC)IgG(Invitrogen公司)，碘化丙啶(PI)和RNA酶A(Sigma公司)。AEG120型电子天平(日本岛津)，WTB150型 CO2培养箱(德国Binder)，多功能自动酶标仪(瑞士Tecan)，德国Leica的倒置显微镜、激光共聚焦显微镜以及图像分析软件。

　　13星形胶质细胞的培养和AD细胞模型的建立[6]本实验室前期研究采用新生24 h内的SPF级SD大鼠已成功建立了纯化的原代星形胶质细胞(AS)体外培养技术，经鉴定其细胞纯度达到95%以上。同时采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞毒性，实验结果显示，40 μmol/L的Aβ2535作用于纯化培养的AS，能较好地模拟AD细胞病理损伤。

　　14蛇床子素对AD细胞模型活力的影响

　　141AD细胞模型的建立将纯化培养的AS接种到96孔板上，培养至细胞长满孔底80%左右，吸弃旧的培养液，以终浓度为40 μmol/L的Aβ2535作用于星形胶质细胞24 h后，倒置显微镜下观察细胞的生长状态和形态变化。

　　2010年第27卷广州中医药大学学报程淑意，等.蛇床子素对Aβ2535诱导的星形胶质细胞NFκB活化机制的影响第1期142蛇床子素对AD细胞模型活力的影响将纯化培养的星形胶质细胞按25×104～3×104/孔的密度接种到96孔板中，并随机分为7组：正常组，模型组，001 μmol/L Ost组，01 μmol/L Ost组，1 μmol/L Ost组，10 μmol/L Ost组，100 μmol/L Ost组，6孔/组。24 h后倒置显微镜下见细胞长出突触并呈相互融合状态后，给Ost各浓度组加药，分别于加药后12、24、48 h时，除正常组外，其他各组均加入终浓度为40 μmol/L的Aβ2535继续培养24 h。在所有实验孔中加入CCK8液10 μL，置培养箱中继续培养1 h，可见橙黄色结晶物(即甲臢)形成，采用酶标仪测各孔吸光度(D)值，检测波长为450 nm。

　　15NFκB和IκBα活性的检测

　　151实验分组将纯化培养的星形胶质细胞按1×105/mL的密度接种于6孔板(内置已用多聚赖氨酸包被的盖玻片)，按1 mL/孔、2孔/组分为7组：正常组，01 μmol/L Ost组，05 μmol/L Ost组，25 μmol/L Ost组，125 μmol/L Ost组，Ost对照组(05 μmol/L Ost)，模型组。每孔补充完全培养液至25mL，置培养箱中继续培养。细胞爬片至合适的时间后，除正常组和模型组外其他各组分别加入相应浓度的Ost，作用于细胞24 h之后，除正常组和Ost对照组外其他各组均加入终浓度为40 μmol/L Aβ2535，继续培养。

　　152细胞固定细胞爬片以甲醛固定，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，体积分数70%冷乙醇浸泡，-20℃固定24 h。检测IκBα时参照文献[7]方法，于Aβ作用30 min后进行细胞固定。检测NFκB p65时参照文献[6]方法，于Aβ2535作用24 h后进行细胞固定。

　　153免疫荧光染色及激光共聚焦显微镜观察将细胞爬片以冷PBS冲洗，用含羊血清、TritonX100的PBS室温作用30 min。吸弃上清液后，不洗，加入一抗，4℃过夜。用冷PBS充分冲洗，用PBSNaN3 1 ∶200稀释的二抗，37℃作用1 h，PI染液避光室温下复染20 min。用冷PBS充分冲洗。每张切片任选20个细胞，以Leica Confocal图像分析软件检测核区与胞浆区的荧光值(FN/FC)。

　　16统计学方法采用SPSS 110软件包进行数据的统计分析。

　　2结果

　　21AD细胞模型的建立镜下观察见星形胶质细胞出现明显的毒性损伤，表现为细胞突触减少或回缩，细胞变圆，其表面斑点和沉积物增多，生长迟滞。

　　22蛇床子素对Aβ2535诱导的AD细胞模型活力的影响表1结果显示，低浓度(001～1 μmol/L)Ost各组与模型组在不同时点比较差异均有显著性意义(P&<001)，尤其在作用24 h时，其保护作用最佳。而随着浓度的增加和时间的延长，其保护作用明显减弱，甚至出现毒性作用。　表1不同浓度和时点Ost对Aβ2535诱导的AD细胞模型活力的影响

　　23各组对AD细胞模型NFκB和IκBα活性的影响表2结果显示，模型组NFκB及IκBα的FN/FC值与正常组比较差异均有显著性意义(P&<001)，Ost对照组FN/FC与正常组比较差异无显著性意义(P&>005)。Ost各浓度组FN/FC与模型组比较差异均有显著性意义(P&<005或P&<001)，尤其以01 μmol/L和05 μmol/L浓度的作用为好。图1(彩图见第101页)结果显示:正常组中绿色荧光主要位于胞浆区，仅有极少部分进入红色核区，Ost对照组与正常组基本一致，说明正常情况下，蛇床子素对细胞中的NFκB表达无明显作用，而模型组中绿色荧光较多地进入红色核区，致使核区显示黄色。蛇床子素各浓度组红色核区中的绿色荧光均较模型组少，但随浓度的增高，红色核区中的绿色荧光有增多的趋势，且以125 μmol/L组最多。图2(彩图见第101页)结果显示：正常组中绿色荧光较多进入红色核区，使核区显示黄色，说明正常AS内的IκBα可能处于高表达状态。Ost对照组与正常组的表达情况基本一致。模型组中绿色荧光主要位于胞浆区，仅有极少量进入红色核区。蛇床子素各浓度组红色核区中的绿色荧光均较模型组多，但随浓度的增高，红色核区中的绿色荧光有减少的趋势。表2各组对AD细胞模型中NFκB和IκBα活性的影响

　　3讨论

　　AD是一种中枢神经系统进行性、退行性疾病，其病理表现虽以神经元的退变丧失、纤维缠结、空泡变性为主，但近年来对星形胶质细胞(AS)的研究发现，其在AD发病过程中起着越来越重要的作用。众所周知，Aβ是AD老年斑的核心组成部分，生理条件下的Aβ主要是由AS生成，并能适度活化AS内的NFκB，对Aβ周围的神经元起到保护作用。而在病理条件下，大量沉积的Aβ不仅能诱导AS内NFκB过度活化，释放炎症因子、增加载脂蛋白E(ApoE)的表达、产生氧化应激反应，而且随着时间的延长，还导致Aβ附近AS数量明显减少，沉积的Aβ明显下调神经元内NFκB的活性表达，致使神经元对Aβ的毒性变得异常敏感，两种途径共同作用，促使神经元出现死亡，从而加速AD的发生、发展及恶化[8]。IκBα是NFκB的抑制蛋白，正常状态时与NFκB结合成非活性的复合物穿梭于胞浆与胞核之间。当细胞受到外界因素刺激时，则引起一系列连锁的酶促反应，使IκBα发生磷酸化并与NFκB解离，NFκB随之活化并转入核内，发挥调节基因转录表达的功能。虽然不同的外界刺激通过作用于不同的IκBα，引起NFκB有差别的活化，但几乎所有已知NFκB诱导物均能通过IκBα的降解迅速而短暂地活化NFκB。而活化的NFκB又能够上调IκBα的mRNA水平，促使合成新的IκBα进入细胞核与NFκB结合返回细胞质中，从而保证NFκB活化过程的适时终止[9]。

　　本研究结果显示，40 μmol/L的Aβ2535作用于AS 30 min后，标记IκBα的绿色荧光抗体大量出现在胞浆区，说明Aβ2535能诱导AS内的IκBα迅速磷酸化并与NFκB解离。而40 μmol/L的Aβ2535作用于AS 24 h后，标记NFκB p65的绿色荧光抗体由胞浆区大量进入红色的胞核区。形态学方面，此时的AS在细胞数量和轴突数目上都有明显减少，毒性损伤较大。

　　本研究结果初步表明：在AD病理损伤中，Ost通过上调AS中IκBα的表达，抑制NFκB的过度表达，起到保护细胞的作用。既往研究表明，低剂量的Aβ可激活神经元内的NFκB，作为重要的抗凋亡因子对神经元起保护作用，而高剂量时则下调NFκB活性，诱导细胞凋亡[10]。低浓度的人参皂苷Rg1可上调AD海马神经元细胞模型中NFκB的表达，延长其存活时间，减低死亡率[11]。本研究也发现Ost对AS的保护作用与其浓度有关，低浓度(01 μmol/L和05 μmol/L)的Ost对AS的保护作用更好，其机制可能是Ost通过抑制Aβ诱导的IκBα过度磷酸化，减弱NFκB在AS内的过度活化表达而保护AS，提高神经元细胞抵抗Aβ的能力，为Ost治疗AD提供了新证据，确切机制有待进一步研究。

参考文献

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