高效液相色谱法测定通塞脉微丸中绿原酸、甘草素、肉桂酸和甘草酸单铵盐的含量

　　　　　　 作者：李伟东，蔡宝昌，狄留庆

【摘要】 【目的】探讨高效液相色谱(HPLC)法同时测定通塞脉微丸中绿原酸、甘草素、肉桂酸和甘草酸单铵盐含量的方法。【方法】采用Zorbax 80A ExtendC18色谱柱，以乙腈-体积分数01%磷酸为流动相，梯度洗脱，二极管阵列检测，测定波长λs=276 nm， 参比波长λR=590 nm。【结果】绿原酸在0050 5~1616 0 μg范围内有良好的线性关系，r=0999 9。甘草素在0025 2~0806 4 μg范围内有良好的线性关系，r=0999 9。肉桂酸在0011 1~0355 2 μg范围内有良好的线性关系，r=0999 9。甘草酸单铵盐在0330 0~10560 0 μg范围内有良好的线性关系，r=0999 9。平均加样回收率：绿原酸为9817%，相对标准差(sR)为428%(N=6)。甘草素为9376%，sR为194%(N=6)。肉桂酸为9825%，sR为272%(N=6)。甘草酸单铵盐为10260%，sR为193%(N=6)。【结论】该方法操作简便，结果可靠，重现性好，可作为该制剂质量控制的方法。

【关键词】 通塞脉微丸/化学;绿原酸/分析;肉桂酸/分析;甘草素/分析;甘草酸单铵盐/分析;色谱法，高压液相

通塞脉微丸是在通塞脉片的基础上改进而成的新剂型。该药是由黄芪、当归、金银花、玄参、石斛、甘草等多种中药组成，具有清热养阴、活血化瘀的功效，临床用于血栓闭塞性脉管炎、脑血栓形成及其后遗症等病症的治疗[1]。为了进一步探讨并完善质量控制指标，本研究建立高效液相色谱(HPLC)法同时测定通塞脉微丸中绿原酸、甘草素、肉桂酸、甘草酸单铵盐等指标性成分的含量，旨在为质量控制提供方法，现报道如下。

　　1仪器、试剂与药品

　　11仪器

　　Agilent 1100LCDAD系统，含在线真空脱气机、低压四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、二级管阵列检测器(DAD)、HPChemstation色谱工作站。AG285型十万分之一电子天平(METTLER TOLEDO)。

　　12试剂与药品

　　甲醇为色谱级(美国TEDIA试剂公司);磷酸为AR级(上海佳泰化工有限公司);对照品绿原酸(批号：110753200212)、肉桂酸(批号：07869801)由中国药品生物制品检定所提供。甘草素、甘草酸单铵盐(自制)，经紫外吸收光谱(UV)、红外吸收光谱(IR)、质谱(MS)、核磁共振谱(NMR)等结构测定，高效液相色谱(HPLC)法检测为单一成分，纯度均在99%以上。通塞脉微丸由南京中医药大学中医药研究院制备，批号：031006、031016、031025。

　　2方法与结果

　　21色谱条件[2-3]

　　色谱柱为Zorbax 80A ExtendC18柱(250 mm×46 mm，5 μm)，柱温30℃，流动相为乙腈—体积分数01%磷酸，梯度洗脱，流速为10 min，测定波长λs=276 nm， 参比波长λR=590 nm。梯度洗脱表见表1。

　　22系统适用性试验

　　取供试品溶液5 μL，高效液相色谱仪测试，绿原酸、甘草素、肉桂酸、甘草酸单铵盐的保留时间分别为158、502、535、603 min。理论塔板数按绿原酸计算不低于5 000，4个成分与相邻色谱峰的分离度均大于15。表1梯度洗脱表

　　23对照品溶液的制备

　　精密称取绿原酸、甘草素、肉桂酸、甘草酸单铵盐对照品各适量，置50 mL 量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，即得含绿原酸32120 μg/mL、甘草素16128 μg/mL、肉桂酸7104 μg/mL、甘草酸单铵盐2 11200 μg/mL的混合对照品溶液B1。

　　24供试品溶液的制备

　　取装量差异项下的通塞脉微丸内容物，混匀，研细，取05 mg，精密称定，置于50 mL容量瓶中，加入约40 mL溶剂(V甲醇∶V水=50∶50)超声30 min，待冷却至室温后，定容，摇匀。取出适量离心(12 000 r/min，5 min)后，经045 μm微孔滤膜滤过，即得。

　　25阴性供试品溶液的制备

　　绿原酸、甘草素、肉桂酸、甘草酸单铵盐分别来源于金银花、玄参、甘草3味药材， 按原生产工艺制备缺金银花、玄参、甘草的阴性制剂， 并按照供试品溶液的制备方法制备各阴性供试品溶液。

　　26方法学考察

　　261空白干扰试验取阴性供试品溶液进样5 μL，测定，得HPLC 图谱(图1)。结果显示，阴性制剂对所测组分无干扰。

　　262线性关系考察精密吸取混合对照品溶液B1 5 mL置10 mL 量瓶中，加乙腈稀释至刻度， 摇匀，得到混合对照品溶液B2。依次等比稀释，分别得到混合对照品溶液B3~ B6。各取5 μL 进样， 测定峰面积值。以对照品的量对平均峰面积作图，结果经回归分析，绿原酸在0050 5~1616 0 μg范围内有良好的线性关系，回归方程：Y=1798×103X-2052，r=0999 9。甘草素在0025 2~0806 4 μg范围内有良好的线性关系，回归方程：Y=4598×103X -1259，r=0999 9。肉桂酸在0011 1~0355 2 μg范围内有良好的线性关系，回归方程：Y=1116×104X-5853，r=0999 9。甘草酸单铵盐在0330 0~10560 0 μg范围内有良好的线性关系，回归方程：Y=1548×102X+1956，r=0999 9。

　　27精密度试验

　　取对照品溶液B4，进样，重复6次，测其峰面积，结果绿原酸、甘草素、肉桂酸和甘草酸单铵盐的相对标准差(sR)分别为009%、009%、008%、008%。

　　28稳定性试验

　　取批号为031016的样品，制备供试品溶液，每隔3 h进样，每次5 μL，测其峰面积，结果绿原酸、甘草素、肉桂酸和甘草酸铵盐的sR分别为018%、065%、073%、023%，表明供试品溶液在室温条件下18 h内稳定。

　　29重复性试验

　　取批号为031016的样品6份，分别制备供试品溶液，各取5 μL进样，测其峰面积，计算各成分的质量分数和sR值，结果绿原酸：1148 mg/g、035%。甘草素： 229 mg/g、026%。肉桂酸：101 mg/g、039%。甘草酸单铵盐：8876 mg/g、013%。

　　210加样回收率试验

　　取批号为031016的通塞脉微丸内容物，混匀，研细，取约25 mg，精密称定，平行6份。各加入一定量的绿原酸、甘草素、肉桂酸和甘草酸单铵盐对照品，依法测定含量并计算回收率，结果见表2。

　　211样品含量测定

　　各取3 个批号的装量差异项下的通塞脉微丸内容物， 制备供试品溶液， 每批平行3份， 每份进样2 次， 按外标法计算各成分的质量分数， 结果见表3。表2绿原酸、甘草素、肉桂酸和甘草酸单铵盐加样回收率试验表3样品含量测定结果

　　3讨论

　　通塞脉微丸为中药制剂，成分复杂。已发表的以指标成分定性定量分析方法也多只检测其中的一种成分。目前，对其质量控制主要采用分别测定其中黄芪甲苷、甘草苷和绿原酸的方法[4-5]。因此，通过建立1~2种指标性成分的含量测定方法已不能全面反映和控制中药制剂的质量。本文建立HPLC法同时测定复方中药通塞脉微丸中绿原酸、甘草素、肉桂酸和甘草酸单铵盐的含量，为该产品的质量控制提供方法。

　　本实验考察了不同溶剂系统，如以乙腈—水、甲醇—水、乙腈—酸水等作为流动相进行试验。等度洗脱所检测的几个峰的分离度不理想，改用梯度洗脱后反复调整洗脱程序，最终选择“乙腈—体积分数01%磷酸”进行梯度洗脱来分离样品， 所检测的4个峰均能达到基线分离。

　　本实验还对样品的提取条件进行了考察。选择甲醇、体积分数75% 甲醇、体积分数50% 甲醇、体积分数25% 甲醇、水进行提取， 结果体积分数50% 甲醇提取的样品信息量较多， 峰面积较大。选择回流、超声提取方法进行了比较， 结果超声法与回流法相当，考虑到操作的方便性， 确定选择超声法。不同超声时间和次数的考察结果表明，1 次超声30 min 即能提取完全。

参考文献

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　　[3] 何三民，石森林HPLC法测定甘草中甘草素、异甘草素、甘草苷的含量[J]中草药，2003，34(7)：618

　　[4]李伟东，徐斌，狄留庆，等RPHPLC法测定通塞脉片不同拆方浸膏中绿原酸的含量[J]南京中医药大学学报，2003，19(1)：32

　　[5] 张莉，狄留庆，赵晓莉，等高效液相色谱法测定通塞脉片中黄芪甲苷的含量[J]南京中医药大学学报，2003，19(2)：94