疏肝活血法对下肢缺血模型大鼠血管内皮祖细胞的影响

　　　　作者：黄学阳，林鸿国，王建春，李彦彬，仉玮，刘明，黄羽，蔡炳勤

【摘要】 【目的】观察疏肝活血法对下肢缺血模型大鼠外周血管内皮祖细胞(EPC)的影响。【方法】将50只SD大鼠随机分为3组：中药组20只，模型组20只，假手术组10只。中药组和模型组均采用右下肢股动脉结扎及分支剔除术复制大鼠下肢缺血模型，假手术组仅暴露股动脉但不结扎股动脉及其分支。中药组术后按05 g·kg-1·d-1剂量灌服柴胡疏肝散合大黄虫丸煎剂，连续7 d。检测各组术前1 d、术后第1、3、7天4个时间点大鼠外周血酶学指标肌酸激酶(CK)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、α羟丁酸脱氢酶(HBDH)水平变化及双荧光阳性细胞[CD34+、血管内皮生长因子受体(VEGFR+2)]比例。【结果】术后模型组外周血酶学指标AST、CK、LDH、HBDH水平较假手术组均显著上升，术后第3、7天中药组各项酶学指标水平较模型组及术后第1天均显著下降(P&<005)。术后中药组和模型组反映EPC变化的CD34+、VEGFR2+双荧光阳性细胞比例较假手术组均显著升高(P&<005)，且中药组升高较模型组更为显著(P&<005或P&<001)。【结论】疏肝活血法可有效地改善下肢缺血状态，其作用可能与其能增加外周血EPC数量有关。

【关键词】 疏肝活血法/治疗应用;下肢缺血/中药疗法;血管内皮祖细胞/血液;疾病模型，动物;大鼠

下肢缺血性疾病是指因动脉狭窄或闭塞而引起的一系列疾病，其典型的症状为间歇性跛行，严重者会出现缺血性静息痛、肢端缺血性溃疡和坏疽，甚至导致截肢，严重影响患者生活质量。现代研究表明，血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cell，EPC)及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor ，VEGF)等细胞因子，可促进缺血组织的血管新生和侧枝血管形成，进而促进缺血组织的修复[1-2]，为缺血性疾病的深入研究提供了新的思路。前期研究显示：中医疏肝活血法对治疗下肢缺血性疾病有确切的疗效[3]，但其治疗机理目前尚不明确。本研究尝试从血管新生的角度探讨中医疏肝活血法对促进缺血肢体修复的可能作用机制。现报道如下。

　　1材料与方法

　　11实验动物SD大鼠(SPF级)50只，雌雄不拘，体质量250~300 g，购自广东省实验动物中心，合格证号：SCXK(粤)20030002，粤监证字2008A020。

　　12主要试剂与仪器异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗大鼠血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)单克隆抗体(由美国Santa Cruz公司生产，批号：B1208)，藻红蛋白(PE)标记的抗大鼠白细胞分化抗原34(CD34)单克隆抗体(由美国Santa Cruz公司生产，批号：C1108)，IgG1FITC同型对照抗体(由美国Molecularp Robes公司生产，批号：53419A)，IgG1PE同型对照抗体(由美国Santa Cruz公司生产，批号：E3008)，红细胞裂解液由广东省中医院中心实验室提供。FC500 流式细胞仪由美国贝克曼—库尔公司生产，7180型全自动生化分析仪由日本日产公司生产。

　　13中药制备柴胡疏肝散(陈皮6 g、柴胡6 g、川芎6 g、香附6 g、枳壳6 g、芍药9 g、炙甘草3 g)合大黄虫丸(国药准字：Z32021248)，由广东省中医院实验动物中心制备，将其浓缩成05 g/mL，高压灭菌，4℃ 冰箱保存备用。

　　14模型制备[4-5]与分组实验动物随机分为3组，中药组20只，模型组20只，假手术组10只。以100 mg/L水合氯醛(35 mL/kg)行大鼠腹腔注射麻醉，选右侧腹股沟中点向膝部作一长度约2 cm的纵行切口，紧贴腹股沟下方分离股动脉主干，中药组和模型组行右下肢股动脉结扎及分支剔除术，复制下肢血管缺血模型，假手术组仅暴露股三角，不结扎股动脉及其分支。中药组术后按照05 g·kg-1·d-1剂量灌服制备药物，连续7 d。模型组和假手术组不予给药。3组大鼠实验期间未出现死亡及下肢缺血坏死情况。

　　15观察指标

　　151酶学检查设置术前1 d，术后1、3、7 d共4个时间点，各组在对应时间点经眼眶静脉丛采全血各1 mL，血标本由广东省中医院检验科统一检验，采用酶动力学法检测外周血肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、α羟丁酸脱氢酶(HBDH) 、谷草转氨酶(AST)水平。

　　152CD34+、VEGFR2+的测定按151项下相同时间点采样，采用双色荧光标记流式细胞检测法，观察大鼠外周血双荧光阳性细胞(CD34+、VEGFR+2)比例的变化。具体方法： 每只大鼠各设置1个测定管与同型对照管，每管取乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血50 μL;测定管加FITC标记的抗大鼠VEGFR2单抗和PE标记的抗大鼠CD34单抗各20 μL，同型对照管加相应的2种同型对照抗体，室温避光孵育15 min; 每管加500 μL红细胞裂解液，室温避光孵育20 min;各管加1 mL流式细胞检测缓冲液，1 500 r/min离心5 min，弃上清; 加磷酸盐缓冲液(PBS)300 μL重悬，上机检测。以488 nm氩离子激光激发，每次计数10 000个细胞，用Cellquest软件分析双荧光阳性细胞所占比例。每个标本中测定管的双荧光阳性细胞比例减去对照管的双荧光阳性细胞比例，即为该标本实际的双荧光阳性细胞比例。

　　16统计学方法采用SPSS 130统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验，方差不齐采用秩和检验，检验水平α=005。

　　2结果

　　21各组不同时间点外周血AST、CK、LDH、HBDH水平比较表1~表4结果显示：假手术组各项酶学指标在不同时间点差异无显著性意义(P&>005);中药组和模型组术前与假手术组比较差异无显著性意义(P&>005)。术后各时间点模型组各项酶学指标水平均较假手术组显著升高(P&<005)，术后第3、7天，中药组各项酶学指标水平较模型组及术后第1天均显著下降(P&<005)。

　　22各组不同时间点外周血CD34+、VEGFR2+比例比较表5结果表明：假手术组各时间点及各组术前的CD34+、VEGFR2+ 双荧光阳性细胞比例比较差异均无显著性意义(P&>005)。术后不同时间点模型组CD34+、VEGFR2+比例较假手术组均显著增加(P&<005)。术后第1天，中药组和模型组间比较差异无显著性意义(P&>005);术后第3天，中药组出现上升高峰，术后第7天，中药组仍维持较高水平，与模型组比较差异均有显著性意义(P&<005或P&<001)。1各组不同时间点外周血AST水平比较表2各组不同时点外周血CK水平比表4各组不同时点外周血HBDH水平比较表5各组不同时间点外周血CD34+、VEGFR+2比例比较

　　3讨论

　　31酶学对于反映肢体缺血的意义正常情况下，外周血中CK、LDH、AST、HBDH等酶活性远比组织中的低。当创伤等原因引起机体局部组织缺血缺氧时，无氧酵解导致大量酸性产物堆积，细胞内pH值下降，加重代谢紊乱和供能不足;同时应激反应导致氧自由基的释放，可发生膜脂质过氧化反应，产生一系列脂类过氧化物，直接或间接地作用于细胞各种成分，改变生物膜的结构和功能，使得细胞钠泵功能下降，钙离子通透性增加，造成细胞及线粒体水肿，线粒体内酶释放入胞质，使细胞膜通透性增高，加速细胞内酶入血，引起血清酶学异常，进而加重对缺血组织的损伤[6-7]。故酶学的变化可非特异性地反映组织缺血的严重程度及恢复情况。在本实验中，模型大鼠早期因下肢缺血而出现酶学指标的异常升高，但在后期由于下肢血供的部分改善，酶学指标可呈下降趋势，中药组较模型组下降明显，提示疏肝活血法中药对组织的血供改善有一定的作用。

　　32血管内皮祖细胞对于改善缺血的作用EPC是成熟血管内皮细胞的前体细胞，既可不断增殖，又能定向分化为成熟的内皮细胞，与成熟内皮细胞相比具有迟发性高增殖潜能。EPC与造血干细胞来源于同一祖细胞，在出生后的机体内，EPC同造血干细胞一样定居于骨髓，缺血等因素可以动员EPC从骨髓释放，并在外周循环中运行，刺激邻近的内皮细胞分化及增殖，并直接作用于缺血区域来促进血管新生与血管功能的恢复，从而加快新生血管的形成。基于此，在20世纪末有学者提出了治疗血管新生的概念：即通过应用血管生长因子或其基因，促进缺血组织的血管新生和侧枝血管形成，使缺血得到改善的新的治疗方法[8-9]。

　　在血管新生的复杂过程中，原始的刺激因素是缺血，同时也需要多种促血管生成因子的共同参与，才能使血管新生得到良好的调控。目前认为，血管生成促进因子包括VEGF、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF) 等，其中VEGF是人体内最强的促血管形成因子。VEGF作为血管内皮细胞特异性的有丝分裂原和趋化因子，无论在胚胎发育过程中还是在出生后血管新生中均发挥重要调控作用[10]。Kalka等[11]在VEGF转基因治疗肢体缺血的研究中发现随着VEGF表达水平的增加，外周血内皮祖细胞增加了30倍，证明了VEGF对骨髓源性内皮祖细胞有很强的动员作用。

　　CD34是造血干细胞的主要表面标志之一，VEGFR2是血管系统最早出现的细胞标记，也是鉴定EPC的分子标志之一[12]。胚胎干细胞来源的VEGFR2阳性细胞可以分化形成血管内皮细胞和血管结构[13]，提示其中含有EPC。外周血中存在EPC，同时表达CD34和VEGFR2细胞表面标志的前体细胞，经培养后可表达成熟内皮细胞的表面标志，所以认为同时表达CD34和VEGFR2表面标志的前体细胞可代表EPC的变化水平[14]。

　　本研究结果显示，CD34+、VEGFR+2双荧光阳性细胞在术后第1天开始升高，于术后第3天时出现峰值，尤其中药组升高的程度较模型组更显著，说明组织缺血是EPC释放的有力刺激，而疏肝活血中药对于EPC的释放具有增强效应。这也不难理解，双荧光阳性细胞的升高与酶学的下降呈反比，EPC促进血管新生，而血管新生、侧枝循环的建立则改善了组织的缺血状态。

　　33疏肝活血法治疗肢体缺血的可能作用机制中医认为，下肢缺血性疾病的病因主要是“不通”[ 15] ，“不通”致脉络闭阻，从而出现气滞、血瘀、痰凝等表现。“不通”源于“郁”，而“郁”责之于肝[ 3]。肝为刚脏，主升、主动;肝主藏血和主疏泄，这都反映了肝是调畅全身气机、推动气血和津液运行的一个主要环节。肝作为“将军之脏”的功能模块概念，首先对应激状态起反应，在正邪相争的过程中，自稳调节的正气与致病因素的邪气相互作用过程中，如果病变在机体所能代偿的范围内，“郁”的状态得以纠正，动脉缺血状态得以改善，侧枝循环开放，则可完全纠正或缓解肢体缺血情况[8]。本课题组在治疗下肢缺血性疾病时，采用从“肝”论治的方法，选用柴胡疏肝散合大黄虫丸。柴胡疏肝散为疏肝理气解郁之名方，大黄虫丸为活血祛瘀之经方，两方合用，一为解气之“郁”，一为解血之“郁”，令气血畅通，组织缺血亦得到有效改善。

　　现代研究发现肝主疏泄与大脑皮层的兴奋及抑制，以及植物神经特别是交感神经功能、内分泌系统功能关系密切[16]。现代药理研究证明，疏肝法确可改变人体神经—内分泌的某些物质基础[17]。中医疏肝活血法是否通过神经—内分泌调节发生作用，提高血管生成促进因子(如VEGF)的数量和活性，动员骨髓释放EPC，促进血管新生进而促进侧枝循环的形成，从而改善肢体缺血，其具体机制有待进一步研究。

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